[发明专利]一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种快速高效检测食品中抗生素氧氟沙星残留的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于食品中残留氧氟沙星含量的检测。

背景技术

食品安全检测作为保障食品安全的重要手段，发挥着越来越重要的作用，食品安全检测技术的发展方向呈现两个趋势：一是向设备日趋完善、痕量分析方向发展；另一个是向仪器便携化和现场检测方向发展。食品安全检测中备受关注的检测物包括农兽药残留等项目，研发高通量、快速、灵敏的农兽药检测试剂可谓当务之急。

农兽药残留的检测手段主要有：理化分析法、微生物法、免疫法。其中免疫学检测是农兽药残留检测的发展方向，它可以做到快速和特异性。酶联免疫吸附方法(ELISA法)已经逐步成为食品中农兽药残留检测的一种重要方法。国家兽药安全评价中心的初步调查，国内使用ELISA试剂盒作为兽药残留筛选的检测样本数量远远超过微生物方法和理化分析方法。

免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性、测定方法的简单、快速及高灵敏度、低费用和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。免疫学技术进行分析是特异性很好、检测时间较短的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种高效快速检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及其检测方法，用于食品检测行业中氧氟沙星含量的检测。

本发明的目的通过如下技术方案来完成的：本发明所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒，它是由微孔包被板，氧氟沙星标准品，抗氧氟沙星的抗体，氧氟沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；所述包被板上的封闭液为1％明胶，抗氧氟沙星的抗体稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗体通过合成的氧氟沙星半抗原，并将半抗原与载体蛋白(匙孔蓝蛋白)通过碳化二亚胺法得到偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对氧氟沙星特异性的抗体。

所述的氧氟沙星酶标抗原是以辣根过氧化物酶(HRP)用EDC法合成酶标抗原OFL-HRP。

所述的氧氟沙星标准品是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，氧氟沙星浓度分别为：0μg/L，0.1μg/L，1.0μg/L，5μg/L，25μg/L，100μg/L。

所述抗氧氟沙星的抗体为多克隆抗体，它们均是用氧氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的氧氟沙星半抗原是将氧氟沙星和EDC法作用得到。

一种利用如上所述的检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒进行氧氟沙星的检测方法，该检测方法是：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入50μl氧氟沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50μl酶标氧氟沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的氧氟沙星含量。

所述的检测方法包括如下步骤：

(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟；

(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液；

(3)取出需要数量的微孔板，每个标准品和样本做2个平行，并记录标准孔和样本孔的位置；

(4)每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤1次；

(5)每孔依次加入标准品和样品各50μl，每孔再加入配制好的酶标抗原工作液各50μl，充分混匀1min，37℃反应30min；

(6)取出反应板，每孔加入250μl洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤3次；

(7)每孔加入显色液A液和B液各50μl，避光37℃显色15min；

(8)每孔加入终止液各50μl，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值；