[发明专利]基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子单核苷酸多态性均相检测法

说明书

技术领域： 

本发明涉及ERCC1基因Exon4第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的检测技术领域，尤其涉及一种均相检测法，其通过检测改变的荧光偏振值以监测样品中存在的ERCC1基因Exon4第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性。

背景技术： 

单核苷酸多态性（SNP）指在某一人群的正常个体的基因组内特定核酸位置上有着不同碱基，是人类DNA序列的差异，即染色体基因组序列中单核苷酸改变时发生的DNA序列的多态性变化，SNPs也被称作双等位基因标记。人类基因组30亿个碱基中，大约每300到500个碱基就有一个SNP发生，整个人类基因组大约有2000万SNP。SNP既能在编码基因又能在非编码基因中发生，对人类个体的表型（形态、代谢和免疫状态等），个体对环境致病因素的易感性、抵抗力、药物和治疗的反应敏感性产生重大影响，因此，其检测对生物学研究、药物开发、医学诊断、生物医学和法医学发展有重要意义。

DNA损伤修复是个复杂的过程，通过一系列的DNA修复途径完成，包括核苷酸切除修复和碱基切除修复途径等。ERCC1是碱基切除修复途径中的重要基因，在DNA修复途径中起到了关键性作用，其正常表达是维持该修复功能的分子基础。ERCC1 codonl18 位于第4外显子，是一个沉默SNP，即C/T转换都编码同样的氨基酸天门冬氨酸(Asp)，C/T转换可能与密码子选择减半、ERCC1 mRNA产物及随后的蛋白翻译降低有关，降低了DNA修复能力，可能与个体肿瘤易感性密切相关。同时，DNA修复能力是影响铂类药物的疗效的重要原因。铂类药物(顺铂、卡铂)是化疗的一类重要药物。ERCC1与着色性干皮病基因形成的异源二聚体，能在铂类药物引起的DNA损伤位点的5’端切开DNA单链，保证DNA的修复过程的继续进行，为细胞存活所必需。因此，基因多态不仅与肿瘤的化疗疗效有关，对预后也有影响。在肿瘤的治疗过程中，DNA修复能力增强影响了抗肿瘤药物疗效的发挥，易产生耐药性；DNA修复能力下降有助于有抗肿瘤活性的铂-DNA加合物功能的持续存在，从而对预后产生好的影响。已有很多文献报道ERCC1的SNP与铂类药物化疗敏感性存在明显关系，ERCC1(118)C／T单核苷酸多态性与非小细胞肺癌患者铂类药物化疗后的生存期有显著相关性，ERCC1(118)C／T和T／T基因型患者化疗后的生存期及化疗敏感性明显高于携带C／C基因型的患者。ERCC1(118)SNP与铂类药物化疗后生存期存在一定的相关性有可能作为铂类药物化疗后生存期的预测指标。提示ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的检测不仅可广泛用于生物学研究，也能预警肿瘤发生、预测化疗疗效，为肿瘤早期诊断、预后判定及指导预见性个体化用药提供依据。而且ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性不仅存在于组织中，在外周血、积液和痰液中均可检出，这一优点对相关的生物学学研究及开展早期、敏感无创的诊断意义重大。 

目前，ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性分析方法有很多，RFLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、寡核苷酸连接分析、等位基因特异的PCR、DNA测序、基因芯片、TDI-FP等技术都可分别进行检测，但这些方法涉及扩增、消化纯化、灭活、杂交延伸分管等步骤，多需要电泳和多步后处理，费时费力而效率有待提高。而且在操作过程因需要更换反应管而易发生污染,影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。 

因此，需要获得一种操作简便、特异准确、易标准化和自动化、低成本的ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性检测新方法。 

本发明的实施方案提供了一种测定样品中ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的均相检测法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术的原理如下：具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大，荧光偏振数值增加。 

发明内容：