[发明专利]环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法

说明书

技术领域

本实发明涉及一种微生物的处理方法，具体涉及的是微生物PCR检测技术的前处理方法。

背景技术

在最近的研究中，通过PCR检测不同种类的微生物，对微生物进行直接定性测试已经是常见的研究方法，尤其是环境中常见的细菌等微生物，都需要对菌体进行24小时培养，整体检测时间需要1～2天。

环境中常见的微生物有葡萄球菌属、链球菌属、沙门菌属、志贺菌属、霍乱、弧菌、大肠杆菌等致病菌以及一些无致病功能的菌体。尤其是在牲畜养殖场的环境中，大肠杆菌、沙门菌属、葡萄球菌属等是最常出现的菌群，这些菌群出现在温血动物肠道中引起肠粘膜细胞水与电解质的代解紊乱，是导致幼畜腹泻的主要病因之一。这些菌群在牲畜中主要的传染途径是通过食入了被污染的饲料所致，由于养殖业的特点，饲料都是散放于养殖的环境中的，所以对环境中，特别是牲畜养殖场中的致病菌的及时、准确的检测就显得非常重要。

聚合酶链式反应技术（Polymerase chain reaction,PCR）是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术，能够快速、准确地在体外上百万倍的扩增目的基因或DNA片段。现在应用的PCR技术能在48h内实现对环境中常见致病菌的快速、准确检测，结果与鉴别培养没有明显差异；但是在应对突发性病变时，这种技术需要依靠细菌培养和DNA的提取，操作较复杂，耗时长。而且在PCR扩增过程中，样本中含有大量杂质，且细菌量在不同样本中的差别明显，直接检测可能出现严重的假阴性情况，干扰实验结果。同时，样本中DNA的质量在PCR检测中非常重要，除菌群浓度高低外，缓冲液中离子浓度也会对DNA的质量造成影响，从而直接影响PCR的扩增结果。

发明内容

本发明提供一种无需经过DNA提取即可进行PCR检测，且可减少检测所需时间、简化检测步骤、提高PCR检测效率的环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

环境中常见微生物PCR检测技术的前处理方法，主要由以下步骤构成：

（1）获得样本；

（2）过滤：将样本用双蒸水混匀后过滤，过滤后的液体再用滤纸过滤，得到过滤液；

（3）离心：将过滤液于8500×g～12000×g的离心条件下离心；

（4）洗涤：离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤；

（5）稀释：采用磷酸盐缓冲液对洗涤后的沉淀进行稀释，稀释后菌液浓度不小于1.5×10³CFU/ml，稀释后的菌液即进行PCR检测。

进一步，所述常见微生物为革兰氏阴性菌、葡萄球菌、链球菌或菌肺炎双球菌。

为了更好的实现本发明，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05M～0.2M。

作为一种优选，所述样本采自养殖场环境中。

作为最优的实施方式，所述步骤（5）中稀释后菌液浓度不小于3.12×10³CFU/ml。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明处理后获得的菌液，无需再经过培养基培养和DNA提取的过程，可直接进行PCR检测，简化了检测步骤，减少实验所需时间，可在4小时内获得检测结果；

（2）本发明处理后的菌液与其他方法处理后的菌液相比，当其进行PCR检测时，其检测效率明显提高；

（3）本发明采用8500×g～12000×g的离心条件离心，可保证有效的分离出致病菌；

（4）本发明采用双重过滤以及缓冲液洗涤沉淀的方法，可基本排除样本中影响PCR反应的影响因子，使检测结果更准确；

（5）本发明中稀释后的菌液浓度不小于1.5×10³CFU/ml，保证有效的检测出扩增条带，使检测的结果更准确；

（6）本发明采用浓度为0.05M～0.2M的磷酸盐缓冲液，有效避免磷酸盐缓冲液中的离子对DNA的质量造成影响。

附图说明

图1为样本中大肠埃希菌的PCR扩增产物1%凝胶电泳图。

图2为纯的大肠埃希菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。

图3为样本热裂解法PCR扩增产物1%凝胶电泳图。

图4为样本细菌漂浮法PCR扩增产物1%凝胶电泳图。

图5为样本增菌后PCR扩增样本敏感性比较1%凝胶电泳图。

图6为样本中猪霍乱沙门氏菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。

图7为样本中金黄色葡萄球菌PCR扩增产物1%凝胶电泳图。