[发明专利]检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行鸡产蛋下降综合征病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

鸡产蛋下降综合征(Egg drop syndrome，EDS)又称为鸡产蛋下降综合征-76或减蛋综合征-76(Egg drop syndrome-76，EDS-76)。鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)属于腺病毒科禽腺病毒属III群(Avian adenovirus Group III)。该病的特征是鸡在性成熟前为隐性感染，鸡开产后才表现出临床症状，主要引起产蛋下降及卵壳形成不全等临床症状，引起产蛋量的巨大损失。鸡产蛋下降综合征最初只局限于欧洲，随后澳大利亚、比利时、法国、英国等国家发生该病。李刚等于1991年分离到EDSV，从而证实了EDS在我国的存在。

目前实验室检测EDS的方法主要为病原学方法、血清学方法、病毒核酸检测法，其中常用的方法是血凝试验，常用的血凝试验对象常为鸭胚尿囊液，血清学检测有特异性强，灵敏度高等特点，但是前期准备工作复杂，耗时长、试验过程繁琐，且需要有对应的抗原或抗体。随着分子生物学的迅猛发展，PCR技术得到广泛应用，李文贵等报道了套式PCR检测此病毒，其灵敏度远远高于常规PCR。Raue等用以六邻体为基础的PCR结合限制性酶切分析，成功检测和鉴别诊断了EDSV和12种禽腺病毒。王爱华等用胶体金颗粒为标记物，制备了EDSV胶体金试纸条并对该病毒进行了检测。董春娜等运用等温环介导扩增技术检测EDSV，其灵敏度达60个拷贝，可准确进行鸡产蛋下降综合征病毒的检测。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另外，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。TaqMan荧光定量PCR方法有望在鸡产蛋下降综合征的诊断和预防提供了一种新的方法，同时也为该病毒在自然宿主体内的致病性研究提供了一种新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的荧光定量PCR方法，以提高对鸡产蛋下降综合征病毒的检测能力。

本发明的目的还在于提供一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的试剂盒。

本发明提供了用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物。

进一步，本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。可以使用诸如Primer Express Version 3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物不但适用于已报道的国外EDSV毒株扩增还适用国内EDSV毒株的检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

Taq-EHFP：5’-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3’(SEQ ID NO.2)，

Taq-EHRP：5’-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3’(SEQ ID NO.3)。

探针序列为：

5’FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’(SEQ ID NO.4)。

本发明提供了一种用于实时荧光定量PCR方法检测鸡产蛋下降综合征病毒的标准质粒，其含有EDSV特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于扩增该序列的特异性引物为：

EHF：5’-AAACGGTGTTACCACTGAC-3’(SEQ ID NO.6)，

EHR：5’-AGCTGCTACCCATATCCA-3’(SEQ ID NO.7)。