[发明专利]一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及，尤其涉及的是一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法。

背景技术

霜霉菌是植物的重要病原菌，所致病害通称霜霉病。霜霉菌对寄主植物的破坏性强，危害性大，由霜霉菌引起的植物病害大多难以控制。尤其是果蔬及经济作物易受到霜霉菌侵染，其潜育期短，再侵染频繁，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，导致农业生产的严重损失。

目前，化学农药防治仍是主要防控手段，在霜霉病的防治中发挥着重要的作用。20世纪70年代中期以前，用于霜霉病防治的药剂主要是一些保护性杀菌剂如取代苯基类的百菌清、双二硫代氨基甲酸酯类的代森锰锌及一些铜制剂等广谱型保护性杀菌剂。自70年代后期开始，甲霜灵、霜霉威、烯酰吗啉、氟吗啉等内吸性杀菌剂的使用对该病害的防治取得了划时代的进展。但由于这些内吸性杀菌剂具有较单一的作用位点，长期单一大面积使用后霜霉菌容易对这些杀菌剂产生抗药性，极大的降低了杀菌剂的防治效果，增加了生产成本和农药环境污染的风险。

近年来，人们逐渐意识到病原菌抗药性产生的危害，提出了基于抗药性监测的杀菌剂使用策略。对于一些能离体培养的病原菌通常先进行病原菌的采集、分离，然后测定病原菌群体对杀菌剂的敏感性，明确病原菌对某些杀菌剂的抗性频率，然后指导杀菌剂的合理选用。而霜霉病菌是专性寄生菌，在培养基上不能分离培养，限制了这种方法在霜霉病菌抗药性监测中的应用。我们也尝试从发病叶片上挑取单个孢子囊接种到离体植株叶片上进行病原菌的分离和纯化，但由于单个孢子的侵染效率极低，不能真实地反映病原菌群体对杀菌剂的抗药性情况。因此，迫切需要发明一种简单易行的抗药性监测方法用于专性寄生霜霉病菌的抗药性监测，以科学合理地指导霜霉病的化学防治。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于霜霉病菌抗药性监测的简单、易行的方法。

本发明克服了目前常规抗药性监测方法不能用于专性寄生霜霉菌分离、纯化的缺点，提供了一种直接在离体叶片上测定霜霉病菌抗药性频率的方法。

本发明的技术方案是利用植株离体叶片生物测定法监测霜霉病菌的抗药性频率。该方法的步骤为(I)在待监测区域采集霜霉病病样，带回室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗脱，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊；(II)将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液(1.0×10⁴个孢子囊/mL)；(iii)分别将混合孢子悬浮液用液滴法(20μl/滴)接种到(1)无菌水浸泡30分钟和(2)用2×待侧杀菌剂最小抑制浓度浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面；(IV)将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19℃黑暗条件下保湿培养12h，再于19℃、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；(V)根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。

上述方法中，所述的霜霉病样的采集在每块田间采用5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一并装入保鲜袋中带回室内进行进一步测定。

所述孢子囊悬浮液的制备方法为：室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4℃无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为1.0×10⁴个孢子囊/mL；

所述无菌水和杀菌剂处理叶碟的制备：健康离体叶片优选为植株中部相同叶龄的叶片；叶碟的尺寸为ф2.5cm；将制取的叶碟混匀后分为两份，每份50个叶碟。一份叶碟用无菌水浸泡30min，另一份叶碟用2倍待侧杀菌剂对霜霉菌最小抑制浓度药液浸泡30min。两份处理浸泡过程中均含有0.02％的吐温20和0.1％的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。

所述霜霉病菌混合孢子悬浮液的接种方法为：取出晾干后叶背朝上整齐置于用吸水纸保湿的玻璃培养皿(ф15cm)中，在每个叶碟背面用量程50μL的移液器滴加20μL混合孢子囊悬浮液于叶蝶中央位置。

所述离体叶碟的培养方法为：装有接种叶碟的培养皿在19℃黑暗条件下保湿培养12h，使霜霉病菌孢子完成萌发和侵染过程，再于19℃、12h光暗交替条件下培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，测定每个叶碟上的发病面积。

所述抗药性菌株抗性频率的计算方法为：抗药性菌株的频率(％)＝(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)×100。