[发明专利]褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种褐牛疾病的分子检测方法。

背景技术

家畜遗传疾病(Animal genetic disease)是指由遗传物质变异对家畜个体造成有害影响，表现为身体结构缺陷或功能障碍，这种有害的遗传信息按一定的遗传方式在世代间垂直传递，在某些品种的家系内呈现一定的表达方式，不会延伸到无亲缘关系的个体(张沅，2001)。动物遗传疾病的爆发给畜牧育种和生产者造成巨大经济损失。由于奶牛和肉牛AI繁育体系的建立，种公牛的优秀生产性能基因在全群内的推广传播效率越来越高，对全群奶牛的生产性能改良起到巨大的推动作用。奶牛和肉牛遗传种质资源(包括优秀个体、公牛冻精、优质胚胎)世界范围内交换的日益频繁，也加速了有害基因在世界牛群范围内的传播扩散。

牛蜘蛛腿综合征(Arachnomelia Syndrome，AS；OMIA pheneID139，Group 000059)是一种先天性致死性骨骼畸形遗传病，患病个体出生时或出生不久后死亡。该病最早是于1975年，由德国科学家Rieck和Schade报道的，现除了个别在荷斯坦牛群中散发的患病牛外，该病主要存在于德系西门塔尔牛和瑞士褐牛群体中。虽然在两个品种中，AS症状相似，但遗传基础并不相同。在西门塔尔牛群中，该病是由MOCS1基因外显子11的缺失突变c.1224 1225delCA引起的，该突变将造成移码突变产生不成熟的短链蛋白，突变位点发生在一个该蛋白质物种间共同的保守域前，突变导致MoC结构域丢失，蛋白质在二级结构上也发生变异。(Buitkamp等，2011；焦士会，2011)

在20世纪80年代，欧洲瑞士褐牛中大量报道了蜘蛛腿综合征患病个体(等，1987)，2004年，意大利也报道了4头AS瑞士褐犊牛，并详细描述了其主要的临床症状和病理特征(Testoni，2004)。科学家对历经20年时间收集到的15头患病瑞士褐牛进行系谱分析，所有个体都能追溯到同一个祖先——来自美国Norvic Larry 牛场的瑞士褐公牛LILASON，并且推断AS呈现简单孟德尔隐性遗传病特征(等，2009)。瑞士褐牛群体有可能是由于大量使用这头经高度选育的公牛及其后代的冻精，从而引起该病致病基因的广泛传播，导致发病。

2009年，等对瑞士褐牛群AS进行了研究，使用了覆盖牛29对常染色体的240个微卫星标记，对15头患病个体和36头已知确认的AS杂合子进行全基因组扫描，将基因定位在BTA5上3个连续标记间。进一步精细定位和单倍型分析的结果揭示导致瑞士褐牛蜘蛛腿综合征的致病基因可能存在于BTA5上微卫星标记BMS490和DIK5248之间，跨度约8cM，物理距离在7.19Mb范围内。随后，等(2010)报道了瑞士褐牛AS是由BTA5定位区间内SUOX基因外显子4上的一个G的插入c.363-364insG突变所致。经预测，插入突变c.363-364insG会导致SO蛋白的氨基酸序列从124位置发生移码突变并且会由于移码提前产生终止密码子，最终导致发病。

在我国，新疆褐牛(Xinjiang Brown)是经长期选育培育出来的优秀的乳肉兼用型品种，于1983年通过新疆自治区畜牧厅组织品种审定。新疆褐牛最初是以当地哈萨克牛为母本，引入瑞士褐牛、阿拉托乌牛及少量的科斯特罗姆牛与之杂交改良经长期选育形成。19世纪70年代至今，我国曾大量引入西德、奥地利褐牛和美国瑞士褐牛及其遗传物质(包括冻精及活体胚胎等)进行新疆褐牛优良遗传品质及生产性能的巩固和提高(郑丕留等，1998)。大量外血的引入对新疆褐牛的生产性能提高发挥了重要作用，然而也可能将一些不利的致病基因引入。据文献报道，瑞士和奥地利的瑞士褐牛群体中AS致病等位基因估计频率为0.16(等，2010)，但该致病突变是否已存在于我国新疆褐牛群体中尚处于未知状态。因此，建立褐牛AS致病位点检测方法具有重要意义。

PCR产物测序的方法对于寻找DNA序列上的突变是一种准确性最高的检测方法。使用PCR产物测序的方法，比对测序结果与参考序列能够快速确定测序个体DNA序列与参考序列的差异。