[发明专利]腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带有抗原基因的嵌合载体疫苗及其应用，尤其涉及腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用，属于嵌合载体猪瘟疫苗领域。

背景技术

腺病毒载体因其具有宿主范围广泛、安全性高、病毒粒子稳定、基因组较少发生重排、易于DNA重组技术操作、具有高效递送和表达外源基因等优点，成为最常用的病毒载体之一。复制缺陷性人5型腺病毒载体因缺失了病毒非必需基因区(E1/E3)，使其能够携带大片段的外源基因，又由于它是复制缺陷性的，对人及动物产生一过性感染，安全性高。

RNA复制子，即自主复制病毒RNA，是在RNA病毒感染性克隆的基础上用其它外源基因替换病毒结构蛋白基因、保留其非结构蛋白基因和非编码区而发展的表达系统，它利用正链RNA病毒的自主复制特性，转染细胞后能够在表达病毒非结构蛋白的同时高效表达外源蛋白(余云舟，俞炜源.黄病毒属病毒复制子载体研究进展.生物技术通讯，2006，17(2)：228-231)。RNA复制子疫苗具有很强的优势，如：有自主复制能力，病毒自身调节功能蛋白的表达不受细胞影响，病毒蛋白表达量高等优点(Polo JM，Dubensky TW.Virus-based vectors for human vaccine applications.Drug Discovery Today，2002，7(13)：719-727.)。不足之处是，RNA复制子载体不能有效地进入体内。另外，黄病毒复制子载体蛋白对宿主菌具有一定的毒副作用，这可能是造成黄病毒复制子载体不稳定的主要因素(Rice CM，Grakoui A，Galler R，et al.Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.New Biol，1989，1(3)：285-96.)。

黄病毒eDNA在细菌中存在不稳定性，日本脑炎病毒(JEV)复制子载体也存在这种情况(Lai CJ，Zhao BT，Hori H，et al.Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(12)：5139-5143；Sumiyoshi H，Hoke CH，Trent DW，et al.Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates.J Virol，1992，66(9)：5423-5431.)。目前国内外关于以腺病毒递送JEV复制子表达载体的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种携带抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗；

本发明的目的之二是提供一种构建所述携带抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗的方法；

本发明的目的之三是提供一种腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗，包括：复制缺陷性人5型腺病毒、日本脑炎病毒复制子和待表达的抗原基因；其中，在日本脑炎病毒复制子SpeI位点前(即：位于JEV SA14-14-2株基因组第164-165位核苷酸)插入质粒pCI的内含子序列；待表达的抗原基因位于JEV复制子载体的SpeI和SalI位点之间。

其中，所述质粒pCI的内含子序列的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明所述的“待表达的抗原基因”可以是猪瘟病毒E2基因、猪蓝耳病病毒GP5基因、猪圆环病毒2型Cap基因或猪流感病毒HA基因等抗原基因；优选为猪瘟病毒E2基因。

本发明的另外一种目的是提供一种构建所述腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的方法，包括以下步骤：

(1)将日本脑炎病毒(JEV)复制子插入到腺病毒穿梭载体中；(2)将来自pCI载体的嵌合内含子序列以及待表达的抗原基因插入到JEV复制子中，得到转移载体；(3)将转移载体线性化后转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞，得到重组腺粒；(4)将所得重组腺粒线性化后转染细胞，传代直至出现细胞病变，得到含有表达抗原基因的腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗。