[发明专利]一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法

权利要求书

1. 一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤如下：

（1）待检样品中DNA提取：

称取待检样品，与等重的直径0.5mm玻璃珠一起移至尖底离心管中，加入体积比为1:1的磷酸缓冲液和SDS缓冲液，翻转3~4次；

再加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，振荡后以3 000 rpm的速度离心，上清转移至一1.5 mL离心管；

加入预冷的醋酸钠，混匀，-20℃静置5min，常温离心，上清转移至另一新1.5 mL离心管；

加入冷异丙醇，静置20min，离心，沉淀加入体积百分含量为70%的乙醇洗涤，离心，弃上清，重复洗涤一次，离心；

沉淀自然风干，加入超纯水静置10min，获得DNA粗提液；

（2）使用Promega公司的Wizard DNA Clean-up Systems试剂盒纯化步骤（1）的DNA粗提液；

（3）PCR检测：以纯化的DNA为模板，SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，如果扩增出518bp的核苷酸序列，则证明待检样品中有香蕉穿孔线虫。

2. 根据权利要求1所述直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤（3）所述PCR扩增反应使用的酶为TOYOBO公司的KOD FX酶。

3. 根据权利要求2所述直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤（3）所述PCR扩增的反应体系为25μL：DNA 模板5 μL，2×PCR buffer 12.5 μL，2mmol/L的 dNTP 5 μL，10 μmol/L的SEQ ID NO:1引物0.75 μL，10 μmol/L的SEQ ID NO:2引物0.75 μL，KOD FX酶 0.5 μL，用三蒸水补足体积；反应程序为：94℃预变性2 min，98℃变性10 s，50℃退火30 s，68℃延伸1 min，从变性到延伸进行35个循环，然后72℃再充分延伸5 min。