[发明专利]一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。

背景技术

诺沃克病毒(Norwalk virus，NV)是一种直径27nm的小圆状结构病毒(SRSV)，又被称为诺瓦克样病毒(Norwalk-like Viruses，NLVs)，属于杯状病毒科诺沃克病毒属成员，是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒。1968年在美国Norwalk镇发生了一起胃肠炎爆发流，该病毒是在这些患者的粪便中首次被发现，因此得名。NLV是在社区、学校、机关、军营和家庭中爆发流行的非细胞菌性胃肠炎的主要病原，感染对象主要是成人和学龄耳童，全年均有发生。诺沃克病毒的传播方式是通过粪-口途径传播，主要是通过污染的水源、食物和人-人密切接触传播；临床表现包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻(水样便)，可伴有头痛、低热、乏力及食砍减退，病程一般2-3d，与轮状病毒等引起的其他病毒性腹泻相比，NLV引起的腹泻多伴有呕吐症状。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便，可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。

诺沃克病毒(Norwalk virus，NV)的基因组为正单链RNA，全长7.65Kb，编码3个开放读码框(open reading frarnes，ORFs)，分别编码非结构蛋白、外壳蛋白和一种功能还不清楚的蛋白：ORFs1编码具有RNA多聚酶活性的非结构蛋白前体，为非结构蛋白；ORFs2编码衣壳蛋白；ORFs3编码一种强碱性蛋白，与基因库中任何蛋白质的序列都无相似之处，其功能尚不清楚。诺沃克病毒成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。根据RNA聚合酶区域衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较，将诺沃克病毒分为2个基因组：基因组I，代表株NV，包括SV等、Desert Shield virus(DSV)等；基因II组，代表株SMV，包括HV、Mexio virus(MX)等。

目前诺沃克病毒的常规检测方法主要是电镜法(EM)、放射性免疫试验(RIA)和酶联免疫法(ELISA)。诺沃克病毒被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要手段，具有直接、可靠的优点，但由于诺沃克病毒在电镜下缺乏显著的形态学特征，且敏感性低、价格昂贵、技术条件要求高，不适合检验检疫实际工作需求；用RIA法检测出急性期和恢复期之间抗体升高4倍以上，对流行病学调查更有意义，但RIA法实验时间需6d时间，同时还需要放射性同位素标记，对操作人员和环境造成不良影响；酶联免疫法(ELISA)特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法，但由于诺沃克病毒体外培养还未成功，可用试剂的病毒抗原数量受到限制。传统的RI-PCR也被用于诺沃克病毒，但检测时间需要6小时，在热循环后要用电泳对扩增产物进行检测分析，步骤繁琐，还会在实验操作过种中有可能发生污染；实时荧光RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、速度快、抗污染、高通量等优点逐渐取代了传统RT-PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

所述报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、DABCY1、BHQ1或BHQ2。

一种检测诺沃克病毒核苷酸的方法，该方法以样品RNA为模板，利用如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示的引物以及序列表SEQ ID No.3所示的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。

所述实时荧光RT-PCR扩增的反应体系如下：2.5μL 10×One Step RNA PCR Buffer，终浓度为0.4mM的dNTP，终浓度为400μM的引物，终浓度为200μM的探针，终浓度为2.5U的Taq酶，终浓度为20U的RNase Inhibitor，终浓度为2.5U的AMV RTase XL，5μL样品RNA，10.5μL RNase Free dH₂O。