[发明专利]从麦曲中提取微生物总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸提取技术，尤其是指从固体麦曲中提取微生物总DNA。

背景技术

黄酒与啤酒、葡萄酒并称为世界三大发酵古酒，黄酒源于中国，有文字记载的酿酒历史达2500年，享有“国酒”的美誉。黄酒低耗粮、低酒度、高营养，是一种集营养和保健为一体的酿造酒，并具有烹饪、药用等功效，符合酒类市场低度、营养、保健的消费趋势，因而被国家列为重点扶植和发展的饮料酒之一。从2002年起，我国黄酒的产量每年都以两位数的速度增长，2005年国内黄酒产量突破200万吨。

黄酒自身源远流长的酿造工艺相当复杂而独特，堪称世界一绝，而麦曲又是中国黄酒生产敞开式发酵最为经典和独创之作。麦曲是小麦经轧碎加水制成块状，在夏末初秋的气候下，对自然生境中的多种微生物进行富集培养，形成了包含所产生各种酶及代谢产物的培养物体系。而正是源于多菌种多酶系及其协同作用形成的丰富的代谢产物奠定了黄酒的品质和风格。处于这些不同酿造环境中的微生物，在生产过程中通过不同的代谢途径相互组合、切断、阻遏和调节，完成了多种微生物混合发酵过程的复杂代谢和代谢产物的多样性，富集了大量让酒出香显味的物质和前体，而正是这些才形成了具有数千年酒文化历史且只有中国有之的黄酒的特殊魅力。可以说，参与黄酒酿造过程的多种微生物是黄酒典型的特征和独一无二的资源，是黄酒生产和发展的基础。对这些酿酒微生物进行研究和发掘，对黄酒的资源保护以及科学和经济发展均有重要的价值。

酿造黄酒离不开乳酸菌参与生化反应，在一定程度上由乳酸菌代谢产生的乳酸与酵母发酵生成的酒精反应生成乳酸乙酯的含量，决定了黄酒的风味。乳酸菌群与酵母菌、曲霉菌共同参与黄酒发酵，俗称“三边发酵”。在黄酒发酵过程中，降低和维持低PH值，形成黄酒中有效成分乳酸。黄酒为开放式发酵，而乳酸杆菌的大量生长，能够产生并累积乳杆菌素以及维持低PH值，抑制其他细菌的生长繁殖，而对酵母无抑制作用。在黄酒前发酵与主发酵期间，主要是高温乳酸菌生长、繁殖、发酵。而在酿酒发酵的后期，主要是低温乳酸菌群的生长、繁殖、发酵。由于厌氧乳酸菌的繁殖，代谢产生较多乳酸，使酒醪酸度上升，有效地抑制了其他的部分杂菌的代谢活动。同时在乳酸菌生长代谢过程中，会产生一些具有抗微生物活性的物质，如有机酸、过氧化氢、二氧化碳等。这些物质均在体外表现出抑菌活性，而且很多乳酸菌都能产生细菌素，如乳链菌素、噬酸菌素、乳酸杆菌素等，这些物质在保持和改善黄酒酿造微生态环境的稳定与协调中发挥着重要的调节作用。而且在后发酵中由于醪温降低，形成部分高温乳酸菌死亡、自溶，给酵母和低温乳酸菌发酵提供了丰富的营养物质。

建国以来对于黄酒制曲、制酒以及地域环境中的微生物，已有了许多研究并取得了一定成果。但是这些研究都是采用的传统技术和方法，如先分离再用培养基培养菌株、以及采用平板计数和生物量测定等分析方法，而这些方法都有着自身的局限性和偏差性。一方面，参与黄酿造过程的微生物多种多样，而目前能分离得到的不过三百余种，还有大量菌株是不可分离和培养的，这些微生物变成了研究的盲区，但是这其中有许多可能是参与酿造的关键所在。随着高通量测序技术和宏基因组学研究的兴起，目前的技术已经能对不能分离培养的微生物进行基因分析，然而如何从固体的麦曲中，将所有微生物的DNA都有效的提取出来，以及避免麦曲本身小麦的基因组污染，以防止测序时，产生大量的小麦基因组数据，成为了目前的技术关键。现有的一些核酸提取试剂盒，有从土壤、粪便等提取细菌总DNA，但尚未出现针对酿酒麦曲中提取所有细菌以及真菌的DNA提取试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能提取麦曲中所有细菌以及真菌的基因组DNA的方法，其能实现小麦的DNA污染非常低，并且成本低廉，得到的DNA总量高，足够用于后续的高通量测序，real time PCR鉴定等研究。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从麦曲中提取微生物总DNA的方法，依次包括以下步骤：

①、向1g固体麦曲中加入2.5～3.5ml的Tris-EDTA浸泡，均匀混合后静置；吸取浸泡液；

将浸泡液低速离心，得首次上清液(低速离心的目的是将一些固体颗粒除去，而细菌比较小，在低速离心下，不会沉淀下来，所以还在首次上清液中)；

将首次上清液高速离心，得沉淀(高速离心将所有细菌都离心下来，然后重悬于后续少量的Tris-EDTA中，目的是浓缩体积)；

将沉淀重悬在180～220μl的Tris-EDTA中，均匀混合；