[发明专利]适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子

权利要求书

1.一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子，其特征在于其序列如SEQ ID No:19所示。

2.如权利要求1所述的一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子的的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

以转基因大豆品系DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2基因组DNA为模板进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物20μM各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为：P_DP356043 SEQ ID No:13、P_DP305423 SEQ ID No:14、P_GTS40 SEQ ID No:15、P_Lectin SEQ ID No:16;

利用重叠延伸PCR将P_DP356043与P_DP305423相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_DP356043与P_DP305423各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物DP305-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423}  SEQ ID No:17 ；

利用重叠延伸PCR将P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物GTS40-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423+GTS40} SEQ ID No:18；

将P_{DP356043+DP305423+GTS40}和P_Lectin克隆进pMD18-T载体，分两步进行：

第一步：用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将P_{DP356043+DP305423+GTS40} SEQ ID No:18和pMD18-T载体分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接，获得含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒；

第二步：用限制性内切酶BamH I和PstⅠ将P_Lectin片段SEQ ID No:16和含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；获得将转基因大豆品系GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系特异性序列片段及大豆内源标准基因Lectin特异性片段融合在pMD18-T上的标准质粒分子，将其命名为pGDP，其序列如SEQ ID No:19所示, 将pGDP转化大肠杆菌JM109即可长期保存使用。