[发明专利]一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙门氏菌(Sal.spp.)进行检测的试剂盒。通过本发明的试剂盒可实现对食品等样品中沙门氏菌的检测。 

背景技术

沙门氏菌(Sal.spp.)是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌的统称，目前已发现的有近一千种，大多数仅能引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。 

由沙门氏菌引起的人类疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是污染动物性产品，进而引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌是引起人类食物中毒的主要病原菌之一，在美国，每年大约报告40000例沙门氏菌感染病例，实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能未确诊，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。我国有些省、市该菌引起的食物中毒占据榜首。2009年8月，四川会东，由于食用了沙门氏菌污染的食物引起217人先后中毒。 

目前常用的沙门氏菌检测方法包括：1)传统的培养方法。总体可分为4个阶段或步骤。预增菌，选择性增菌，分离，生化鉴定。需要4～7天，才能得出明确的诊断结果。2)免疫标记技术。利用抗原抗体的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法进行检测，但该方法的灵敏度和特异性均较差。3)分子生物学检测方法。目前有PCR技术，实时荧光定量PCR和LAMP方法。以上几种方法易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，并且不能区分活菌和死菌，阻碍了其大规模推广使用。 

核酸恒温扩增技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，其特点为扩增反应的全过程均在单一温度，反应时间大大缩短。而以RNA为模板快速扩增，产物为RNA的恒温扩增技术尤其适合RNA检测，且不易污染(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)，满足沙门氏菌快速检测与监测工作的需要。本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)；在此两项技术的基础上，本发明沙门氏菌核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。 

在使用已知的磁珠-RNA富集技术和SAT技术检测临床样本中某特定靶核酸的实践中，为 了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高检测的准确性，一个关键性的技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的捕获探针、引物和单链核苷酸探针。本发明人将磁珠-RNA富集技术和SAT技术应用于沙门技术的检测，成功完成了本发明。 

发明内容

本发明涉及一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒，特别是涉及以磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术早期、快速诊断食品等样品中沙门氏菌存在的试剂盒。 

因此，本发明的目的是提供一种使用磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术来定性检测样品中沙门氏菌的试剂盒，特别是涉及沙门氏菌的早期感染在实验室诊断中的应用。其基本原理为：首先由捕获探针对靶核酸进行捕获；然后利用带T7启动子的下游引物、特异上游引物和特异单链核酸探针，使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现核酸扩增，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由荧光检测仪器捕获。 

本发明所提供利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒包括：(1)分别装有裂解液、核酸提取液、洗涤液、Sal.spp.反应液、Sal.spp.检测液、SAT酶液、Sal.spp.内标、Sal.spp.阳性对照、Sal.spp.阴性对照并加盖密封的多个试剂瓶或管和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒。