[发明专利]检测样品中的甲基化DNA的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及从含DNA的样品检测甲基化DNA的方法。

【背景技术】

高等真核生物的染色体DNA中已知构成DNA的碱基之中C(胞嘧啶)的5位被甲基化。这样的DNA的甲基化作为基因表达的控制结构发挥功能。例如，在某基因的启动子区域存在的富含CpG序列的区域(也称为“CpG岛”或“CG岛”)被甲基化时，其基因的转录被抑制。此现象也称为“基因的沉默”。对此，当CpG岛不被甲基化时，由于转录因子可结合到启动子，从而基因的转录变得可能。

如上所述，DNA的甲基化是基因表达的控制结构之一。即，DNA的甲基化在初期胚发生、组织特异性的基因的表达、作为哺乳动物中特征性的现象的基因印迹及X染色体的失活、染色体的稳定化、DNA复制之时机等各种各样的生理的及病理性的现象中实现重要的作用。再者近年明白，DNA的甲基化的异常、即，由DNA的甲基化所致的基因的沉默，与癌等的疾病相关。因此，对于各种的基因检测甲基化DNA的重要性近年越发增加。

检测甲基化DNA的方法在所述技术中已知各种方法，可例举例如亚硫酸氢盐测序法、使用甲基化感受性限制酶的方法、使用甲基化DNA免疫沉降的方法(MeDIP法)等。亚硫酸氢盐测序法是通过亚硫酸氢盐的作用将DNA中的非甲基化胞嘧啶变换为尿嘧啶，通过确定碱基序列，检测DNA中的被甲基化的部位。使用甲基化感受性限制酶的方法是利用甲基化感受性限制酶不可切断被甲基化的识别序列的特点，通过检查其切断结果来检测甲基化DNA。MeDIP法是使用特异性地识别甲基化DNA的抗体或甲基化DNA结合蛋白质来进行免疫沉降，通过将得到的甲基化DNA供于微阵列解析等来检测甲基化DNA。再有，此方法也被称为MeDIP-Chip法。

在特开2008-263961号公报中公开了在使用甲基化感受性限制酶的检测甲基化DNA的方法中，使用抗甲基化DNA抗体将样品中的甲基化DNA固定到固相，用甲基化感受性限制酶进行消化处理的方法。

如此，甲基化DNA的检测的重要性增加，期望新的检测甲基化DNA的方法的开发。

【发明内容】

本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不以任何程度受此发明内容部分的影响。

本发明旨在提供用于检测样品中的甲基化DNA的新的方法。

本发明人惊人地发现，通过使可结合到甲基化DNA的蛋白质和甲基化DNA结合，该甲基化DNA不被脱氧核糖核酸酶完全地分解而残留，再者得到的脱氧核糖核酸酶分解产物不给检测步骤带来影响，从而完成本发明。

即，本发明是：

(1)检测样品中的甲基化DNA的方法，其包括：

使有含甲基化DNA的可能性的样品和可与甲基化DNA结合的蛋白质接触，从而使上述样品中的甲基化DNA和上述蛋白质结合；

使通过上述结合步骤得到的样品和至少1种脱氧核糖核酸酶接触，而将上述样品中的DNA分解；及

在通过上述分解步骤得到的样品中，通过与上述蛋白质的结合来检测不被上述脱氧核糖核酸酶分解的甲基化DNA；其中

上述脱氧核糖核酸酶的至少1种是与可分解单链DNA的甲基化感受性限制酶不同的脱氧核糖核酸酶。

(2)(1)所述的方法，其中

上述可与甲基化DNA结合的蛋白质是抗甲基化DNA抗体或甲基化DNA结合蛋白质。

(3)(1)所述的方法，其中

上述可与甲基化DNA结合的蛋白质是抗甲基化DNA抗体。

(4)(1)所述的方法，其中

上述可与甲基化DNA结合的蛋白质是选自下列的至少1种甲基化DNA结合蛋白质：MBD1、MBD2、MBD4及MeCP2。

(5)(1)～(4)之任一项所述的方法，其中

上述样品是由培养细胞株或从活体采集的血液、体液、组织或细胞制备的样品。

(6)(1)～(4)之任一项所述的方法，其中

上述脱氧核糖核酸酶是选自下列的至少1种：脱氧核糖核酸酶I、外切核酸酶I、λ-外切核酸酶、T7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJ型外切核酸酶、外切核酸酶T、BAL31核酸酶、绿豆核酸酶、微球菌-核酸酶及T7内切核酸酶。

(7)(1)～(4)之任一项所述的方法，其中

上述样品是有含单链甲基化DNA的可能性的样品，

在检测上述甲基化DNA的步骤中，检测单链甲基化DNA。

(8)(1)～(4)之任一项所述的方法，其中