[发明专利]香蕉束顶病毒的实时PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术应用领域，涉及一种检测香蕉束顶病毒的实时PCR检测方法和依据该方法建立的试剂盒。

背景技术

香蕉是我国南方重要的经济作物，是南方一些城市水果业的支柱产业和重要的出口农产品，远销日本等国家。目前香蕉病毒病一直是我国香蕉生产和香蕉组培苗出境的主要限制因素之一。香蕉束顶病是香蕉病害中最为严重的一种。

香蕉束顶病毒(BBTV)是香蕉束顶病的病原，引起植株束顶及明显矮化，叶片外缘黄化，叶脉、叶柄和假茎具墨绿色条纹。其传播途径主要有香蕉交脉蚜(Pentalonia nigronervosa)吸食感病植株后，再吸食健康植株时传播香蕉束顶病毒，引发健康植株发病。由于发病后，没有有效的化学试剂控制，严重时造成毁灭性灾害，此病正在世界的香蕉种植区蔓延。

BBTV检测是病毒防治、流行趋势研究、香蕉无病毒苗鉴定的重要前提和环节。

现有检测技术中，常用方法是酶联免疫吸附法(ELISA)，但暂无症状的香蕉植株、香蕉种苗特别是组培苗，由于植株幼小，体内病毒含量很低，用ELISA的方法常常会出现漏检和误检的情况；普通PCR的检测方法，其灵敏度要比ELISA方法高1000倍以上，非常适合检测低浓度病毒的样品，但现有的方法对待检样品的制备技术操作复杂用时长、费用高，且容易造成样品交叉污染，对感病样品的带毒量也不能定量。

因此，用于检测香蕉束顶病毒的检测方法有待于进一步改善。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种方法简单，能够相对定量，并在一定程度上减少样品交叉污染，检测效率高且准确的检测方法。

为了实现上述目的，本发明所提供的BBTV实时PCR快速检测方法如下：

制备香蕉植株检测样品：取已知感染BBTV的、未感染BBTV、和待测的香蕉的叶片、叶脉或假茎样品1-2mm²，放置于PCR管中，加50-100μL新鲜配制的缓冲液A，95℃孵育10分钟之后，加等量缓冲液B，-20℃保存备用，取1μL上清液用于实时PCR扩增；

制备传毒介质-香蕉交脉蚜(Pentalonia nigronervosa)中的检测样品：(1)将从香蕉植株采集的整头香蕉蚜虫用毛笔轻轻置于0.5mL的Eppendorf管中，用枪头挤破蚜虫后，加入20μL缓冲液A，94℃ 10分钟，再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用；(2)用纤细的针或纤细的移液枪枪头准确的刺向蚜虫的淋巴部位，将针或枪头置于20μL缓冲液A，于94℃10分钟，再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用；(3)轻触饱食后的蚜虫，诱导蚜虫分泌蜜露，用针头蘸取少量蜜露置于20μL缓冲液A，于94℃ 10分钟，再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用，(1)、(2)、(3)均取1μL上清液用于实时PCR扩增；

实时PCR扩增：反应引物，根据GenBank公布的香蕉BBTV外壳蛋白基因(CP，BBTV component 3)序列(Accession number：AY534140)，从中选择保守序列设计引物F1和R1，其中F1序列为5’ACCAGCCGACT(a)ACA(c)TGTCTG 3’，R1序列为5’TCCTCAACACGGTTGTCTTC 3’；并利用Primer express(1.0，PE Applied Biosystem)设计TaqMan探针，探针序列为5’ACATTCAACATCTGATGTCCCTGTTGC 3’，探针位于上下游引物之间，探针的5′端标记荧光素FAM，3′端标记荧光素TAMRA，上述引物的特异性和保守性强，几乎包括已发现的来自世界各地的BBTV株系，如夏威夷、斐济、汤加、印度、海口等，反应在iCycler^TM Real-Time Detection System(Bio-rad)上进行，反应体系(20μL)：2×TaqImmomix(BioLine)10μL，MgCl₂(50mM)1.8μL；上、下游引物(5μM)1μL；Taqman探针1μL；20％PVP-40 1μL；1％BSA 1μL；1μL样品上清液；其余用超纯水补足到20μL。反应条件为：95℃变性7分钟；95℃变性30秒；58℃复性30秒；72℃延伸30秒；循环50次。温度转换率为20℃/秒，在每个循环的延伸阶段收集荧光信号，荧光收集模式设为F1/F2。