[发明专利]香蕉束顶病毒的实时PCR快速检测方法

权利要求书

1.一种用于检测香蕉束顶病毒的实时PCR扩增引物和探针，其特征在于：

根据GenBank公布的香蕉BBTV外壳蛋白基因(CP，BBTV component 3)序列(Accession number：AY534140)，从中选择保守序列设计引物F1和R1；并利用Primer express(1.0，PEApplied Biosystem)设计TaqMan探针，探针位于上下游引物之间，探针的5′端标记荧光素FAM，3′标记荧光素TAMRA，其中F1的序列为5’ACCAGCCGACT(a)ACA(c)TGTCTG 3’，R1的序列为5’TCCTCAACACGGTTGTCTTC 3’，TaqMan探针的序列为5’ACATTCAACATCTGATGTCCCTGTTGC  3’。

2.一种香蕉束顶病毒的检测方法，包括如下步骤：

(1)分别提取无明显感病症状的香蕉植株和传毒介质-香蕉交脉蚜中的病毒DNA检测样品，备用；

(2)以(1)步提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针进行实时PCR扩增；

(3)2小时后读取数据，判断样品是否带毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：提取无明显感病症状的香蕉植株中的病毒DNA的步骤如下：

(1)取1-2mm²待检测香蕉组织，放置于PCR管中；

(2)加50-100μL新鲜配制的缓冲液A，95℃孵育10分钟；

(3)之后，加等量缓冲液B；-20℃保存备用，取1μL上清液用于实时PCR扩增；

其中缓冲液A为100mM NaOH，2％20；缓冲液B为100mM Tris-HCl，2mMEDTA。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：提取传毒介质-香蕉交脉蚜(Pentalonia nigronervosa)中的病毒DNA的步骤如下：

(1)将从香蕉植株采集的整头香蕉蚜虫用毛笔轻轻置于0.5mL的Eppendorf管中，用枪头挤破蚜虫后，加入20μL缓冲液A，94℃10分钟；再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用；

(2)用纤细的针或纤细的移液枪枪头准确的刺向蚜虫的淋巴部位，将针或枪头置于20μL缓冲液A，于94℃10分钟；再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用；

(3)轻触饱食后的蚜虫，诱导蚜虫分泌蜜露，用针头蘸取少量蜜露置于20μL缓冲液A，于94℃10分钟；再加入20μL缓冲液B，-20℃保存备用；

(1)、(2)、(3)均取1μL上清液用于实时PCR扩增，其中缓冲液A为100mM NaOH，2％20；缓冲液B为100mM Tris-HCl，2mM EDTA。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行实时PCR扩增反应条件如下：

反应在iCycler real-time System(Bio-rad)上进行，反应体系为20μL，由以下成分组成：2×Taq Immomix(BioLine公司)10μL和MeCl₂(50mM)1.8μL，上、下游引物(5μM)1μL，Taqman探针1μL，20％PVP-40 1μL，1％BSA 1μL，1μL样品上清液，其余用超纯水补足到20μL；反应条件为：95℃变性7分钟，95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环50次，在每个循环的延伸阶段收集荧光信号，荧光收集模式设为F1/F2。

6.一种用于检测香蕉束顶病毒的试剂盒，其特征在于包含如下成分：

(1)权利要求1所述的引物和探针；

(2)缓冲液A：100mMNaOH，2％20；

(3)缓冲液B：100mM Tris-HCl，2mM EDTA；

(4)2×Taq Immomix；50mM的MgCl₂；20％的PVP-40；1％的BSA。