[发明专利]利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学基因表达调控领域，更具体的涉及利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，它适用于山羊同一组织细胞在不同发育时期、不同生理条件下microRNA介导的靶基因的差异筛选，或者不同组织细胞在相同的发育时期microRNA介导的靶基因比较研究。

背景技术

microRNA是大约18-24bp的小的非编码RNA，它在转录后调控基因的表达。是1993年首次发现的一类在动植物中发挥重要作用的基因表达调控因子。它们通过依赖于microRNA和靶基因互补性的降解或者抑制翻译的两种不同机制负调控靶基因的表达水平。在大多数哺乳动物中，microRNA通过5’末端第2～8bp的序列互补配对靶基因mRNA，在翻译水平负调控基因的表达，5’末端的这2～8bp的序列称为种子序列，它在各个物种中都是高度保守的，并且通过与靶mRNA完全互补配对介导基因的表达调控。许多研究表明正是microRNA 2～8bp种子序列的突变或者与之完全互补配对靶mRNA一个或者几个碱基的突变导致microRNA功能缺失，进而引起生理状态的改变。microRNA与靶基因组成复杂的调控网络，一个microRNA可以与多个靶基因相互作用，多个microRNA也可能作用于同一个靶基因，另外microRNA及其靶基因不同时期、不同生理条件、不同组织其表达量均存在差异。因此，如何准确定位、分析microRNA靶基因成为许多科学家关注的问题。

靶基因挖掘方法主要有两大类：计算机预测和基于杂交的基因芯片。其中，计算机预测虽然快速、简单，但这种主要基于microRNA种子序列与其靶基因之间碱基互补配对的最小自由能的计算机方法，由于短小序列的存在，容易出现假阳性，需要大量的实验验证，且以表达谱数据已知为背景；基因芯片是基于杂交策略的主流技术，自发明以来，它一直在基因表达谱技术中占据优势地位。该技术利用过表达microRNA的样本及其对照的mRNA池与固定在芯片上的数以万计根据已知基因序列设计的探针杂交，以高通量的方式确定mRNA的种类和丰度，从而推测microRNA的靶基因。虽然该技术获得了广泛的应用，但是价格昂贵、需要大量的RNA，且存在数据处理过程噪音难以确定、探针与相似转录本间交叉杂交等问题。此外，由于要设计探针，它和计算机预测一样需要参考基因组序列信息。

因此，为了研究山羊组织或者器官的microRNA靶基因的情况，也为其它物种提供一种研究与某个microRNA相关的靶基因的分子方法，我们在miRBase已有数据的基础上，搜寻获得microRNA种子序列互补配对的序列，利用真核生物mRNA带有polyA尾巴的特点，在反转录酶作用下，加入带有特殊接头的反转录引物，合成第一链cDNA，然后，通过特异设计的两步PCR反应，富集与microRNA相互作用的所有靶基因，将其特异性扩增获得可以用常规凝胶检测到的核苷酸序列，并辅以PAGE技术，定位、分析与某个特异microRNA序列相互作用的靶基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种实验性的、简便快速的、高特异性的获取哺乳动物组织或器官microRNA靶基因的分子方法。包括以下步骤：

1)特异反转录引物的设计

所述反转录引物包括锚定碱基VN(N代表A、T、C或者G；V代表碱基A、G或C)、12个T、寡核苷酸CTGA(3’到5’端)以及特殊接头SEQ ID NO.2。锚定碱基VN、12个T的寡聚核苷酸保证了cDNA的从头合成，SEQ ID NO.2的引入有利于特异两步PCR的设计。

通过反转录引物将样本所有mRNA反转录成带有特殊接头SEQ ID NO.2的cDNA。

2)特异两步PCR反应

所述特异两步PCR反应的引物由根据miRBase16.0数据库提供的与某个microRNA种子序列相互配对的核苷酸序列与特殊接头SEQ ID NO.1的上游引物，和待扩增cDNA上带有的特殊接头SEQ ID NO.2的下游引物组成。为保证特异性，这两个特殊接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在动物基因组中或转录组中是不存在的。