[发明专利]利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的方法

权利要求书

1.利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)合成反转录引物；

(2)合成包含不同接头序列的上、下游PCR引物；

(3)消化去除基因组污染，对样品总RNA的提取；

(4)采用步骤(1)的反转录引物将样品RNA反转录获得cDNA；

(5)采用步骤(2)上下游PCR引物，两步PCR法获得某一microRNA的靶基因序列；

(6)PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其片段大小和表达丰度；

(7)切取靶基因条带，重扩增、回收、克隆、测序。

2.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于涉及到的两条接头序列在山羊基因组中或转录组中不存在，分别具有SEQ IDNO.1和SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(1)所设计的反转录引物具有SEQID NO.3所示的核苷酸序列，为接头SEQ ID NO.2下游紧接4个动态碱基下游紧链接12个T以及锚定碱基NV的组合，其中，N代表A、T、C或者G；V代表碱基A、G或C。

4.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(3)中采用DNaseI消除基因组DNA污染。

5.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(4)以纯化的组织总RNA为模板，以SEQID NO.3所示序列为反转录引物，在反转录酶作用合成带有SEQ ID NO.3的cDNA。

6.根据权利要求5所述反转录反应，其特征在于反转录体系如下：总RNA 4μl，反转录酶0.5μl，反应缓冲液2μl，SEQID NO.30.5μl(50μM)，RNase-free ddH2O 3μl；反应条件：37℃，15分钟，85℃，5秒。

7.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(5)特异两步PCR上游引物具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，结构特征为接头SEQID NO.1与microRNA种子序列互补序列的组合；下游引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于特殊两步PCR法上游引物为SEQ ID NO.4；下游引物为SEQID NO.2。

9.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(5)PCR扩增分两步进行，第一步PCR反应体系：cDNA 1μl，SEQ ID NO.43μl(10μM)，master Mix(TaKaRa)12.5μl，ddH2O 7.5μl；反应条件：94℃预变性5分钟；94℃，40秒，37℃，30秒，72℃，1分30秒，5个循环；第二步PCR反应体系在第一步PCR产物中加入SEQ ID NO.21μl(10μM)；反应条件：94℃预变性5分钟；94℃，40秒，60.5℃，30秒，72℃，1分30秒s，32个循环。

10.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(6)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离扩增的靶基因，并利用凝胶辅助分析工具检测片段的大小和表达丰度，利用microRNA与靶基因相互作用的特点，辅以PAGE和凝胶分析工具，可视化不同时期、不同生理状态下基因水平表达差异，检测各个泳道片段的大小和表达丰度，作为区分不同样本的标志。

11.根据权利要求1所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(7)切取的靶基因条带重扩增的条件为94℃预变性5分钟；94℃，40秒，60.5℃，30秒，72℃，1分30秒，共计32个循环。然后通过克隆、测序获得靶基因核苷酸序列。