[发明专利]Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆及大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种采用Taqman探针及多重引物实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法。

背景技术

目前对健康人的大便标本的研究中已知肠道内栖息着大约10¹⁴个细菌，是人体细胞总数的10～20倍，约400～500种。大量的研究结果表明，肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、多种疾病的发病机制及健康等起着重要的作用。因此肠道内细菌定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。

在对细菌进行检测时，最传统的是采用传统培养计数，但是由于自然环境尤其是极端环境中存在大量不可培养的微生物，大量微生物的不可培养性是传统微生物生态学在提示自然界微生物群落结构组成、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。细菌纯培养检测方法耗时长、特异性差、敏感度低，精确性差等缺点。

采用分子生物学方法检测细菌或者病毒目前已经是较为普遍的一种检测手段，但是普通PCR方法只能做到定性或相对定量，不能对目标物进行准确定量。SYBR GREEN荧光定量PCR方法检测，SYBR Green在PCR反应过程中和双链DNA结合，随着PCR产物的增加，PCR产物与SYBR Green结合的量也增大，虽可以达到定量目的，但嵌入染料不能识别错误的扩增产物或反应过程中产生的引物二聚体，会影响定量结果。且容易在操作过程中由于污染而出现假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用Taqman探针及多重引物实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，为更详尽的肠道菌群结构的测定，评估抗生素使用对肠道菌群的影响，评估益生菌对肠道菌群结构影响的准确性和敏感性的定量的分析研究提供了最新的手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，包括步骤：

A)提取待检测样品中双歧杆菌及大肠杆菌的细菌基因组DNA；

B)依据双歧杆菌和大肠杆菌的相关序列合成引物及Taqman探针：

所述的双歧杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-AGAGTGGCGAACGGGTGA-3’，R：5’-AGGACGCGACCCCATCCC-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-bif：5’-HEX-ATGCGTGACCGACCTGCCCC-TAMRA-3’；

所述的大肠杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-ACAATGGGCGCAAGCCT-3’，R：5’-TCTGCGGGTAACGTCAATGA-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-eco：5’-FAM-CAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGC-TAMRA-3’；

C)将步骤B所述因为和探针与其他PCR反应试剂组成反应体系，进行Taqman探针实时定量PCR反应。

目前基于16SrRNA基因分析的分子技术，被认为是细菌鉴定的是黄金标准，细菌16SrRNA分子量相对适中，其基因核苷酸序列具有高度保守性，但其保守性又是相对的，不同科、种、属间都具有一定的变异，通过对保守区与特异性区域的分析，设计出特异性引物与探针，可对不同科、种、属的16SrRNA的特异引物进行PCR扩增，可以实现对肠道菌群中某些细菌甚至整个微生态系统的动力学变化进行监测，揭示肠道微生物系统种群的多样性、数量和动力学。

Taqman探针荧光定量PCR方法对于传统的PCR技术有了其他的明显优势：①有效解决了传统的定量只能终点检测的局限，对PCR反应进行实时监控。②有效解决了PCR污染的问题，从配好反应液到结果分析完成，整个过程均在闭管条件下进行，有效避免了PCR产物的交叉污染和对实验室的污染。③特异性更强，因为荧光信号的产生不仅依赖于靶模板的扩增，还依赖于靶模板同探针的杂交，既保证了灵敏性又减少非特异扩增。④可以通过对不同探针标记不同荧光染料，实现多重检测。