[发明专利]Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆及大肠杆菌的方法

权利要求书

1.一种Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，包括步骤：

A)提取待检测样品中双歧杆菌及大肠杆菌的细菌基因组DNA；

B)依据双歧杆菌和大肠杆菌的相关序列合成引物及Taqman探针：

所述的双歧杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-AGAGTGGCGAACGGGTGA-3’，R：5’-AGGACGCGACCCCATCCC-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-bif：5’-HEX-ATGCGTGACCGACCTGCCCC-TAMRA-3’；

所述的大肠杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-ACAATGGGCGCAAGCCT-3’，R：5’-TCTGCGGGTAACGTCAATGA-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-eco：5’-FAM-CAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGC-TAMRA-3’；

C)将步骤B所述引物和探针与其他PCR反应试剂组成反应体系，进行Taqman探针实时定量PCR反应。

2.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：

所述的A)步骤中双歧杆菌及大肠杆菌的基因组DNA是在同一粪便样品中进行，采用QIAamp DNA stool minikit进行提取，除去细胞碎片及杂质的工艺为：取0.2g样品添加0.1mm的300mg玻璃珠(Sigma-Alorich，USA)，1.4ml ASL buffer(QIAamp DNA stool minikit(Qiagen，Hilden，Germany)，高速剧烈涡旋振荡2min，95℃热孵育5min，重复高速剧烈涡旋振荡2min，匀浆物中加入180μl蛋白酶(20mg/ml)，37℃for 30min，5000g离心3min。

3.如权利要求2所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的同一样品为新鲜人类粪便样本；采集样品后迅速置于4℃，24小时内送于实验室存于-80℃。

4.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的B)步骤中合成双歧杆菌和大肠杆菌的扩增引物及Taqman探针时，首先查找双歧杆菌和大肠杆菌及相关细菌16rRNA序列，进行多重比对，分析出序列的保守区及特异性区域，确定出多对引物及探针，同时保证两种目的物探针荧光尽量没有相互干扰，然后对设计的引物及探针进行初步筛选，再次根据所得信息调整选取的引物对序列，合成这些引物及探针组后，分别用单PCR验证所有引物及探针是否可以扩增目的片断，及扩增反应的特异性，进一步筛选出实验可行的引物及探针。

5.如权利要求4所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的双歧杆菌和大肠杆菌及相关细菌为金黄色葡萄菌、肺炎链球菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯菌，布拉氏酵母菌、酪酸梭菌、枯草杆菌、绿脓杆菌和乳酸菌。

6.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述C)步骤的反应体系包括反应体系为：

所述的反应条件及程序为：反应程序：

95℃        30s；