[发明专利]具有双重结合活性的抗MRSA-PBP 2a的单克隆抗体

说明书

技术领域：

本发明属单克隆抗体技术领域(生物医学技术领域)，特别是，实验已证实了一种能够特异性识别金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原表位，并可区分MRSA和MSSA的单克隆抗体。 

背景技术：

MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)，即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是全球性导致病人感染的最重要的耐药致病菌之一。此菌对常用的多种抗生素广泛耐药，其中包括甲氧西林，其主要耐药机制是由于MRSA菌体产生的青霉素结合蛋白2a(Penicillin Binding Protein 2a，PBP 2a)，蛋白分子量为75kDa；此蛋白由菌体染色体，即mecA基因编码，大量实验证实，PBP2a对β-内酰胺类抗生素呈现低亲和力的结合，从而导致耐药性。依据本菌对抗生素的耐药性和敏感性，在临床上分为MRSA和MSSA(对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)两类。 

发明内容：

制备和鉴定出能特异性且高亲和力结合MRSA的PBP 2a蛋白的两种单克隆抗体，该抗体也能进一步区别MRSA和MSSA。 

确定了两种单克隆抗体结合MRSA的PBP2a蛋白抗原表位，10A10.F2细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，即位于氨基酸27～46；4B10.B6细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS，即位于氨基酸375～400。 

另一方面，本发明还包括一种来源于MRSA的PBP2a抗原表位，该抗原表位能与单克隆抗体特异性结合，从而用于区分MRSA和MSSA。 

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位为S.aureus(MRSA)的PBP2a蛋白的27～46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY  和375～400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。 

在本发明的具体实例中，所述的两种抗原表位包括核心氨基酸EDK。 

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位能被4B10.B6细胞株产生单克隆抗体特异性识别。 

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位能被10A10.F2细胞株产生单克隆抗体特异性识别。 

在本发明的另一具体实例中，还包括一种区别MSSA和MRSA的方法，步骤包括：(i)分离制备耐药性及非耐药性葡萄球菌，并获取菌体培养上清及裂解液为鉴定样品； 

(ii)将能够与MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合而不能与MSSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合的单克隆抗体与生物样本作用，所述的单克隆抗体还具有能够区分MRSA和MSSA菌的特性； 

(iii)检测单克隆抗体与生物样本的结合物，由此，鉴定生物样本中的MRSA菌。 

在本发明的具体实例中，所述的单克隆抗体为鉴定的4B10.B6细胞株产生。 

在本发明的另一具体实施例中，所述的单克隆抗体为鉴定的10A10.F2细胞株产生。 

附图说明：

为使更加容易理解本发明，下面结合附图，进一步阐述本发明。 

图1.鼠抗MRSA单克隆抗体与培养的MRSA细胞蛋白特异结合的免疫印迹分析。样品经12％SDS-PAGE电泳分析，1.MR1(15μL/泳道)；2.MS1(15μL/泳道)；3.E.coli(15μl/泳道)；4.MR2(15μl/泳道)；5.MS2(15μl/泳道)；6.Protein Marker，MR1和MR2来源于MRSA菌，MS1和MS2来源于MSSA菌。 

图2A和2B.鼠抗MRSA单克隆抗体与体外表达的PBP2a蛋白结合免疫印迹分析。 

2A：1.Marker；2.PBP2a(2μg/泳道)；3.MR1(15μL/泳道)。 

2B：1.PBP2a(2μg/lane)；2.PBP2a(0.2μg/Lane)，3.MR1(15μL/泳道)。 

图3.显示单克隆抗体4b10.b6与合成肽抗原1733和1734的结合。包被抗原(100ng/孔)，非相关肽作为对照，常规包被96孔板，4℃包被过夜，封闭液封闭1小时，加入抗体的系列稀释液，然后加入过氧化物酶标记的抗鼠二抗(1∶20,000)检测。