[发明专利]一种利用枯草杆菌高效生产重组脂肪氧合酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用枯草杆菌高效生产重组脂肪氧合酶的方法。

背景技术

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12)，简称脂氧酶，属氧化还原酶，可催化含顺-顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸等)及酯形成氢过氧化物，生成的不稳定氢过氧化物能氧化面筋蛋白质形成二硫键，使蛋白质分子聚合，从而达到增强面筋的作用。脂氧酶还可以通过偶合反应破坏类胡萝卜素的双键结构，使得面粉漂白。因此，脂氧酶兼具面粉强筋和增白的功效，可以减少或替代化学强筋剂溴酸钾及化学漂白剂过氧化苯甲酰的使用，降低其对人体健康的危害。但由于目前脂氧酶主要从动植物组织中分离提取获得，产量低、纯度不够是制约其大规模应用的主要原因。脂氧酶的分离提取、结构分析和酶学性质研究是目前国内外学者的主要研究方向。对于如何实现脂氧酶的高效生产和工业化应用，目前国内相关研究甚少。

食品用酶属于大宗工业产品，下游一般采用低成本的分离提取手段，不能保证诸如大肠杆菌热源物质完全去除；如果采用复杂的纯化方法，则成本就成为应用的限制性因素。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌，分泌蛋白能力强，细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA将其列为GRAS(Generally Recognized As Safe)级别的微生物。枯草杆菌表达系统已被成功地用于多种蛋白的表达，大部分是具有工业应用价值的酶，尤其是蛋白酶和淀粉酶。虽然关于外源蛋白表达的研究枯草杆菌还远远落后于大肠杆菌，但是在表达和分泌活性蛋白方面则明显优于大肠杆菌，在食品基因工程研究中更具有大肠杆菌无法比拟的优越性。近年来关于枯草杆菌应用于食品基因工程的研究，越来越受到重视。随着分子生物学和基因工程的飞速发展，有理由相信枯草杆菌表达系统将更加完善，成为原核蛋白表达的最佳宿主之一。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用枯草杆菌高效生产重组脂肪氧合酶的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，包括如下步骤：

(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌；

(2)将所述的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌接种于装液量为58-63mL/250mL(表示每250ml三角瓶装液58-63mL)的加入15-18g/L乳糖的LB培养基中，27-30℃、180rpm条件下培养85-90h，离心收集上清液。

其中，步骤(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌的方法为：

I.克隆鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列为SEQ ID NO.1；

II.鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX与分泌表达载体pHBSR连接得到pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体；

III.pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体电转化枯草杆菌宿主WB800得到含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌。

所述的分泌表达载体pHPSB通过如下方法构建：

i.构建载体pHB-hc：合成一对引物P1：SEQ ID NO.2/P2：SEQ ID NO.3，退火使之可以配对形成双链，两端形成ClaI、XhoI的粘性末端；将退火双链产物与pHB201先后经ClaI、HindIII酶切得到的5.4kb大片段连接，得到载体pHB-hc；

ii构建载体pHP43：以枯草芽孢杆菌168(Invitrogen)基因组为模板，P43-F：SEQ ID NO.4/P43-R：SEQ ID NO.5为引物，PCR扩增获得P43启动子，P43启动子经XhoI/ClaI双酶切后插入经同样双酶切的载体pHB-hc中，得到载体pHP43；