[发明专利]一种利用枯草杆菌高效生产重组脂肪氧合酶的方法

权利要求书

1.一种利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌；

(2)将所述的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌接种于装液量为58-63mL/250mL的加入15-18g/L乳糖的LB培养基中，27-30℃、180rpm条件下培养85-90h，离心收集上清液。

2.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于步骤(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌的方法为：

I.克隆鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列为SEQ ID NO.1；

II.鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX与分泌表达载体pHBSR连接得到pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体；

III.pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体电转化枯草杆菌宿主WB800得到含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于所述的载体pHPSB通过如下方法构建：

i.构建载体pHB-hc：合成一对引物P1：SEQ ID NO.2/P2：SEQ ID NO.3，退火使之可以配对形成双链，两端形成ClaI、XhoI的粘性末端；将退火双链产物与pHB201先后经ClaI、HindIII酶切得到的5.4kb大片段连接，得到载体pHB-hc；

ii构建载体pHP43：以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，P43-F：SEQ ID NO.4/P43-R：SEQ IDNO.5为引物，PCR扩增获得P43启动子，P43启动子经XhoI/ClaI双酶切后插入经同样双酶切的载体pHB-hc中，得到载体pHP43；

iii.构建载体pHP43R：以枯草杆菌168基因组为模板，P3：SEQ ID NO.6/P4：SEQ ID NO.7，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌淀粉酶E启动子基因PamyE；以枯草杆菌168基因组为模板，P5：SEQ ID NO.8/P6：SEQ ID NO.9，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌分子伴侣Sec分泌途径分子伴侣PrsA；以P3为上游引物，以P6为下游引物，以PCR反应产物PamyE和PrsA基因片段混合物为模板，利用PCR的方法扩增获得启动子PamyE介导的PrsA表达的表达框PamyE-PrsA；载体pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶处理，与经ClaI酶切的PamyE-PrsA片段经T4连接酶连接获得载体pHP43R；

iv.构建分泌表达载体pHBSR：以SnprB-F：SEQ ID NO.10/SnprB-R：SEQ ID NO.11为引物，以枯草杆菌168基因组DNA为模板PCR扩增SnprB信号肽，通过EcoRI/BamHI双酶切反应获得SnprB信号肽基因，与同样双酶切处理的pHP43R载体通过T4DNA酶连接获得分泌表达载体pHBSR。

4.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于步骤(2)中装液量为250ml的三角瓶装60～62mL培养基，优选250ml的三角瓶装61.31培养基。

5.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于步骤(2)中加入的乳糖终浓度为16～17g/L，优选加入的乳糖终浓度为16.9g/L。

6.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于步骤(2)中发酵温度为28～30℃，优选发酵温度为29.71℃.

7.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，其特征在于步骤(2)中发酵时间为87～89h，优选发酵时间为88.49h。