[发明专利]抗鳗弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种抗鳗弧菌卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是一种流行性很广的水产动物病原菌，对海水、淡水动物均能致病，常年来给养殖户带来了巨大的损失。据报道，鳗弧菌能感染牙鲆、鲈鱼、鲑鱼、黄鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鳕鱼、大菱鲆等；它是多种对虾的致病菌，对罗氏沼虾、栉孔扇贝等虾类、贝类的免疫系统具有强烈的刺激作用，是弧菌中危害较高的菌。

目前对于鳗弧菌引起的疾病的防治手段最要有以下几种：抗生素、中草药、灭活疫苗、单克隆抗体等。抗生素和化学药物易引起应激反应，对生物有不同程度的毒性，且反复使用容易产生耐药性，存在药物残留，在倡导绿色农业的今天必将退出历史舞台；中草药的药效持久，但却很难迅速起效，且各地区中草药药性差别较大，使用不易控制，多用于疾病预防；疫苗接种是防治细菌性疾病最直接有效的方法，国外已经有多种商品化疫苗出售，但我国水产疫苗研制起步晚，到目前为止仅有草鱼出血病疫苗获得了商品化生产批准，疫苗的研发、生产、销售及广泛使用都需要相当长一段时间。

卵黄抗体（IgY）是从经抗原免疫的禽类所产卵中分离的具有特异性的蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产、廉价的抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的特异性IgY的量（约200mg）远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量。IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。高效卵黄抗体可以通过注射、拌饵投喂、浸泡等方式对水产动物起到保护剂疾病治疗作用，还可用于免疫学检测等领域。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，但在水产行业的研究开发还处于基础阶段，目前在水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒病、抗贝氏隐孢子虫病、抗副溶血弧菌病以及抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体，但是，目前还没有关于抗鳗弧菌卵黄抗体及其制备方法和应用的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供提供一种抗鳗弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用，该卵黄抗体纯度较高，且对鳗弧菌有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便便于低成本、大批量生，其制备方法简便易行，可用于由鳗弧菌引起的疾病的预防和治疗上及开发鳗弧菌检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗鳗弧菌卵黄抗体，采用鳗弧菌为抗原免疫蛋鸡，收集高免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋卵黄进行分离和纯化得到抗鳗弧菌卵黄抗体。

一种抗鳗弧菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备鳗弧菌抗原并灭活

接种鳗弧菌于LB固体琼脂培养基，28℃倒置培养18h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在28℃，160rpm的条件下，摇床振荡培养10h后，调节LB液体培养基中的鳗弧菌菌量为2×10⁹CFU/ml，然后离心分离得到含有鳗弧菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌生理盐水混合得到鳗弧菌菌量为2×10⁹CFU/ml的菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5%，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的鳗弧菌抗原，放4℃冰箱备用；

(2) 免疫蛋鸡并收集鸡蛋

将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1）得到的鳗弧菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1）得到的鳗弧菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；

（3）卵黄抗体分离和纯化

将步骤（2）得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，然后在卵黄中加入卵黄体积10倍的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4℃冰箱静置10h，然后在4℃，10000g条件下离心20min，得到初提纯液，将初提纯液进行盐析，将盐析得到的沉淀用与卵黄等体积的浓度为0.01mol/L的pH为 7.2的PBS缓冲液重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到抗鳗弧菌卵黄抗体。