[发明专利]抗鳗弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用

权利要求书

1.一种抗鳗弧菌卵黄抗体，其特征在于：采用鳗弧菌为抗原免疫蛋鸡，收集高免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋卵黄进行分离和纯化得到抗鳗弧菌卵黄抗体。

2.一种根据权利要求1所述的抗鳗弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备鳗弧菌抗原并灭活

接种鳗弧菌于LB固体琼脂培养基，28℃倒置培养18h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在28℃，160rpm的条件下，摇床振荡培养10h后，调节LB液体培养基中的鳗弧菌菌量为2×10⁹CFU/ml，然后离心分离得到含有鳗弧菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌生理盐水混合得到鳗弧菌菌量为2×10⁹CFU/ml的菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5%，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的鳗弧菌抗原，放4℃冰箱备用；

(2) 免疫蛋鸡并收集鸡蛋

将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1）得到的鳗弧菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1）得到的鳗弧菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；

（3）卵黄抗体分离和纯化

将步骤（2）得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，然后在卵黄中加入卵黄体积10倍的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4℃冰箱静置10h，然后在4℃，10000g条件下离心20min，得到初提纯液，将初提纯液进行盐析，将盐析得到的沉淀用与卵黄等体积的浓度为0.01mol/L的pH为 7.2的PBS缓冲液重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到抗鳗弧菌卵黄抗体。

3.根据权利要求1所述的抗鳗弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的盐析过程为：首先向初提纯液中加入终饱和度为40%的饱和(NH₄)₂SO₄????，4℃冰箱静置10h后，4℃，10000g，离心20min得到一次沉淀；然后将一次沉淀用140g/LNa₂SO₄重悬浮，4℃冰箱静置10h后，4℃，10000g，离心20min得到二次沉淀，所述的二次沉淀即为盐析得到的沉淀。

4.一种根据权利要求1所述的抗鳗弧菌卵黄抗体的效价检测方法，其特征在于采用间接酶联免疫吸附试验检测抗鳗弧菌卵黄抗体的效价，具体包括如下步骤：以10⁹CFU/ml鳗弧菌包被酶标板，4℃冰箱静置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBST洗涤液洗涤3次后加入含1%BSA的封闭液，室温封闭1h，洗涤3次后加入倍比稀释的抗鳗弧菌卵黄抗体，每梯度设1平行，同时设立空白对照和阴性对照，37℃恒温水浴2h后，洗涤3次，加入辣根过氧化酶标记的羊抗鸡二抗，37℃恒温水浴1h，洗涤5次后加入OPD显色液显色15min，H₂SO₄终止反应后用酶标仪读取波长492nm吸光值，待测样品与阴性对照吸光值大于2.1判定为阳性，最大阳性稀释度为抗体效价。

5.根据权利要求1所述的抗鳗弧菌卵黄抗体的效价检测方法，其特征在于：PBST洗涤液为吐温-2000与PBS缓冲液按体积比1:2000的比例混合得到。

6.一种根据权利要求1所述的抗鳗弧菌卵黄抗体的应用，其特征在于：该鳗弧菌卵黄抗体可用于由鳗弧菌引起的疾病的预防和治疗上，并可用于开发鳗弧菌检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。