[发明专利]一种禾谷镰刀菌的分子检测方法及应用

说明书

一.技术领域

本发明属于作物病害诊断及防治技术领域，具体涉及一种禾谷镰刀菌的分子检测方法及应用。

二.背景技术

由镰刀菌(Fusarium spp.)(Fusarium head blight，FHB)引起的小麦赤霉病是一种广泛流行的世界性病害，主要发生于温暖湿润地区，是影响小麦高产、稳产和优质的重要因素之一。20世纪90年代以来，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病灾情严重。我国南方长江中下游冬麦区发生严重，随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区以及西南和西北麦区扩展(Ma等，2008)，几乎蔓延到所有小麦种植区。2003年，长江中下游地区60-80％的麦区感染赤霉病，减产超过20％。2005年，江苏省赤霉病的发生面积为1800万亩左右，占全省总种植面积的72％。2011年，全国农业技术推广服务中心预报全国赤霉病流行面积为6500万亩。

小麦赤霉病的发生与流行还带来巨大的食品安全性隐患。镰刀菌可以产生单端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉会发生呕吐、腹泻及食欲不振等急、慢性中毒症状，严重者可导致死亡(陆维忠等，2001)。据美国估计，因此类毒素污染所造成的直接经济损失仅199l～1996年间就高达三亿美元。我国、欧盟和美国、加拿大均要求面粉、面包、饼干等食品中DON毒素的限量标准为1000μg/kg(1ppm)(Buerstmayr等，2009；GB 16329-1996)。因此，明确我国小麦赤霉病致病菌的种类与产毒类型，对开展小麦赤霉病防治与抗病育种都有重要的实践意义。

自20世纪40年代中国首次报道小麦赤霉病以来，国内外研究认为，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)是小麦赤霉病的主要致病菌之一，也是中国小麦赤霉病的优势致病菌。近年来的研究表明，F. graminearum是一个含有许多特定种系的复合种(Fg Complex)，O’Donnell等(2004，2007)通过系统发生学分析，将Fg Complex划分成13个特定的正式命名的种。根据该项研究结果，目前中国小麦赤霉病的致病菌，主要为禾谷镰刀菌(F.graminearum)和亚细亚镰刀菌(F.asiaticum)，其中北方麦区如西北麦区和东北麦区，年平均温度低于15℃时，麦区赤霉病的优势致病菌为禾谷镰刀菌(Qu等，2008)。因此，快速、准确鉴定检测禾谷镰刀菌，有利于对北方麦区小麦赤霉病的防治。

传统的镰刀菌鉴定方法主要通过形态学，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐，没有统一的规范标准，并且需要丰富的实践经验。随着遗传与分子生物学技术的迅速发展，分子标记也成为鉴定镰刀菌的主要技术手段。与常规的形态鉴定法相比，分子标记能准确、快速地从混合群体中鉴定出不同病菌类型，为准确、快速分析病菌的群体分布、特点和鉴定诊断提供新方法。

Nicholson等(1998)找到了一对鉴定禾谷镰刀菌的标记Fg16F/R，但在扩增来自不同地区的禾谷镰刀菌株时得到6种PCR产物，不能有效地区分菌株的种类。Qu等(2008)利用该对引物，并结合AFLP标记，鉴定出Fg16F/R扩增产物为类型1和AFLP扩增产物为类型A的菌株为禾谷镰刀菌。由于AFLP标记操作繁琐，且涉及到酶切和两次PCR扩增等步骤，难以在实际检测中推广应用。Yang等(2008)利用氨连接酶基因的单核苷酸多态性(SNP)设计了4个引物试图来区分Fgcomplex中的七个种，其中鉴定禾谷镰刀菌需要扩增出536bp和311bp等2条不同大小的条带，并且还需要通过条带的强弱进行辅助判断，并不能真正满足快速简易检测的要求。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是：提供有效而容易获得的方法鉴定禾谷镰刀菌，使之可以直接从麦穗、种子、饲料中快速、灵敏、准确检测出赤霉病致病菌禾谷镰刀菌。

本发明的技术方案为：1.设计禾谷镰刀菌检测的特殊引物。2.禾谷镰刀菌检测体系的建立。

1.设计禾谷镰刀菌检测的特殊引物。

根据禾谷镰刀菌DNA序列的特性，设计了对禾谷镰刀菌具有特异扩增作用的一对引物：引物15′-GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3′和引物25′-TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3′。

2.禾谷镰刀菌检测体系的建立。

a)提取病原菌基因组DNA；