[发明专利]一种用于启动子分析的慢病毒T载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于该T载体基于慢病毒穿梭载体设计而成，将荧光素酶报告基因与绿色荧光蛋白报告基因通过内部核糖体进入位点相连接，可在同一顺反子中，表达两种不同的报告基因。

2.如权利要求1所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于所述的慢病毒穿梭载体为慢病毒穿梭载体CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus。

3.如权利要求1所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于所述的荧光素酶报告基因插入去除启动子后载体中的多克隆位点区。

4.一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）慢病毒穿梭载体CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus中酶切去除EF启动子；

2）将步骤1）得到的酶切产物转入感受态细胞中，构建无启动子载体CSⅡ-MCS-IRES2-Venus；

3）应用PCR从载体pGL4.0中扩增荧光素酶报告基因，并连接入T载体pMD19-T Simple中，得到质粒pMD19-Luc2 Simple；

4）通过步骤3）得到的质粒pMD19-Luc2 Simple将荧光素酶报告基因克隆至步骤2）得到的载体CSⅡ-MCS-IRES2-Venus的酶切、去磷处理产物中，得到质粒CSⅡ- MCS-Luc2-IRES2-Venus；

5）质粒CSⅡ- MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶反应得到慢病毒T载体pLenti-T。

5.如权利要求4所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤1）中使用限制性内切酶AgeⅠ去除载体多克隆位点前的EF启动子。

6.如权利要求4所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤3）中PCR扩增在基因5’端引物中引入酶切位点NheⅠ、SwaⅠ和BamHⅠ酶切位点，在基因的3’端引物中引入酶切位点BglⅡ。

7.如权利要求4所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤4）中载体CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用BamHⅠ酶切，载体CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用CIAP试剂进行去磷处理。

8.如权利要求4所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤5）中质粒CSⅡ- MCS-Luc2-IRES2-Venus使用SwaⅠ酶切。

9.如权利要求4所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤5）中质粒CSⅡ- MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶在72℃反应 2小时。

10.一种用于启动子分析的慢病毒T载体在体内或体外进行真核生物启动子活性分析的应用。