[发明专利]重组抗原组合物、疫苗、制备该抗原组合物的载体和方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫领域，特别是重组抗原领域，尤其是用于幽门螺旋杆菌感染免疫的抗原、疫苗及其制备方法和载体。 

背景技术

在疫苗制备领域，许多种抗原由于自身抗原性较低或者分子太小等原因而不能激发足够的免疫反应，从而限制了其疫苗开发的可能性和疫苗的有效性。为了克服这一困难，目前采用了许多种方法增加抗原的免疫原性，例如，使用免疫佐剂。常用的佐剂可分为四类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。 

现有佐剂的作用机制包括：(1)改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排除，从而延长抗原在体内的滞留时间，避免频繁注射从而更有效地刺激免疫系统；(2)刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力；(3)刺激淋巴细胞的增生和分化，可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；(4)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应。另外，改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段。Senpuku等(1996)发现将pAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段免疫所激发的抗rpAc抗体明显升高。因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性。 

为了提高目的抗原的免疫原性，人们一直致力于开发更有效更安全的免疫佐剂，以用于疫苗的制备应用。霍乱毒素(choleratoxin，CT)是由霍乱弧菌 产生的分子量为84KD的肠毒素，是一种强有力的免疫佐剂，其作用机制是通过抑制口服抗原的免疫耐受而发挥免疫促进作用。但由于毒性作用、超敏反应等的存在使其应用受到了一定的限制。霍乱毒素由由一个A亚单位(分子量为2707KD)和5个B亚单位(每个分子量为11.7KD)组成。A亚单位是霍乱肠毒素的毒性物质，B亚单位是结合单位，后者可与小肠粘膜上皮细胞上神经苷脂(GM1受体)结合，结合后的毒素分子变构，使A亚单位脱离B亚单位进入细胞膜，同时双硫键降解，分为A1，A2两条多肽，A1为毒  性部分。由于A1亚基的有毒特性，所以不能直接应用于人体。CT-B亚基彼此连接形成五聚体(参见图1)，然后与CT-A2环绕形成AB5结构(参见图2)。CT-B具有增强免疫作用，目前认为是迄今为止最有效最安全的黏膜免疫佐剂之一。 

另一方面，虽然如胃炎，胃溃疡及十二指肠球部溃疡胃炎相关的疾病可能由多种致病因素引起，但研究发现，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)是最常见的病因。HP是世界上感染率最高的细菌之一，据报道，90％的亚洲人和欧洲人60％感染幽门螺旋杆菌，如不治疗将持续感染，引发慢性胃炎、消化性溃疡，甚至导致胃癌。世界卫生组织和美国国立卫生院经过多年研究，已经将HP列为胃癌的首要致癌因子。另外，抗生素以及抗溃疡药物化学治疗药物已经被用于治疗胃炎相关的疾病，在此背景下，抗生素广泛的大剂量应用甚至滥用导致了耐药性菌株的产生，并出现了一些药物的副作用，使得患者的耐受性变差。研究表明耐药性幽门螺旋杆菌引起胃癌的风险更大。在这种情况下，研制一种有效的疫苗可能是预防和治疗幽门螺旋杆菌所导致的消化道疾病的有效途径。 

在疫苗的研发过程中，人们发现，抗原的选择对于疫苗的效果影响巨大，而且单一抗原构建的单效价疫苗经常难以产生足够的免疫应答，从而难以产生完全有效的保护作用。因此，如何选择有效的抗原并构建成多效价的抗原是当前针对幽门螺旋杆菌的疫苗研究中的重要挑战。 

应明确指出的是，虽然上述内容在“背景技术”的标题下描述，但是并 不代表申请人承认上述内容全部为现有技术。相反，为了引出本发明的发明内容，加入了发明人的分析和引申，因此这一部分不应被简单地视为现有技术。 

发明内容

为了增强抗原的免疫原性和免疫佐剂的有效性，本发明提供了一种重组抗原组合物，包括：抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白；和霍乱毒素CT-B蛋白。利用CT-A2与CT-B的结合特性，能够形成上述融合蛋白与CT-B的复合物结构，从而增大了抗原的有效体积。同时，已知霍乱毒素是一种强有力的免疫佐剂，能够抑制抗原的免疫耐受，从而发挥其免疫促进作用。并由于一个CT-A2可以结合多个CT-B而加强了CT-B的效价，从而增强了整个抗原组合物的免疫原性。