[发明专利]一种细菌株的同源性快速鉴别方法

说明书

技术领域   

本发明涉及到一种细菌株的同源性鉴别方法，具体地说是一种在传统细菌分类、鉴别的基础上，通过对细菌短链脂肪酸的种类和含量进行检测，清晰地判别出细菌株的同源性，从而对细菌株进行快速分类与鉴别的方法。

背景技术    

细菌感染性疾病的实验诊断，涉及病源微生物学（含医学、农业、工业、环境微生物）、流行病学、法医学、医院感染学、生物化学等方面的知识和技能，是一门多学科相互渗透的综合诊断技术。微生物学实验室的主要工作是从标本中分离出病原菌株并进行准确鉴别。对细菌同源性判别能及时了解流行性细菌株之间的种、属间亲缘关系，其目的在于：明确细菌病原学诊断、判别细菌与感染间的关系，提供快速、可靠的治疗方案，及时为流行病学防治作指导。细菌感染的同源性鉴别为临床诊断、治疗、预后和流行病学调查以及医院内感染的监控，提供可靠的实验依据。

目前，微生物学实验室细菌感染的同源性鉴别主要依靠细菌核苷酸测序或PCR杂交等，由于细菌是原核生物，核苷酸基因序列较病毒基因复杂，存在实验成本高、实验时间长等缺点。同时，原核生物含有丰富的糖、蛋白质（含抗体、酶系统）及脂类成分。细菌的糖和蛋白质经一百多年的研究，已形成了传统的细菌鉴别方法，即根据细菌的形态、染色、培养特性初步鉴别到科；通过生化反应，利用细菌独特的酶系统，因而对底物（糖、蛋白质）的分解能力及代谢产物差异，进行不同的化学反应，以此可将细菌鉴别到属或种；再利用血清学抗体将细菌鉴别到型。但传统的鉴别方法只能鉴别到种或型，而不能鉴别至株。

发明内容   

本发明所要解决的技术问题在于提出一种快速、简易、成本低、实验过程安全的细菌株的同源性快速鉴别方法。

为解决上述技术问题，本发明一种细菌株的同源性快速鉴别方法包括如下步骤：Ⅰ.根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴别；Ⅱ.利用细菌对糖、蛋白质利用的生化反应进行属或种鉴别；Ⅲ. 利用血清学抗体将细菌鉴别到型；Ⅳ.采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸的种类与含量，得到该细菌脂肪酸指纹识别图谱，进行同源性比较，将细菌鉴别至株。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述同源性比较是采用脂肪酸标准品进行同源性比较，所采用的脂肪酸标准品包括脂肪酸甲酯混合物液，含C5～C20直链饱和脂肪酸甲酯及2-羟基-10碳、3-羟基-10碳、2-羟基-14碳、2-羟基-16碳饱和脂肪酸。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，在采用气相色谱技术测量细菌脂肪酸的种类与含量前，将待测菌接种在无脂质成份的培养基上培养，收集菌落，经皂化、甲基化、萃取、洗涤过程，将细菌脂肪酸从水相转移到有机相。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述菌落的收集过程包括：将细菌按四区画线法接种于无脂肪成份的TSBA平板上，35℃、24h培养，用接种环取第三区的菌落40mg左右，置于无菌、干燥、有螺旋盖的试管底部。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述皂化过程包括：在试管中加入1.Oml的皂化试剂，盖紧试管，震荡试管10s，放入100℃沸水中水浴，5min之后从沸水中移出、冷却，震荡10s；再将试管放回水浴中，继续加热25min；沸水中皂化共30min，冷却。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述皂化过程中所采用的试剂是由氢氧化钠45g、甲醇150ml和水150ml组成的混合液。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述甲基化过程包括：每管中加入2.0ml甲基化试剂，栓紧试管盖子后震荡10s，置80℃水浴加热10 min，用冷水快速冷却至室温，将脂肪酸转化成甲基脂肪酸。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述甲基化过程中所用的试剂是由6.0 mol/L盐酸 325ml和甲醇275ml组成的混合液。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述萃取过程包括：每管加入1.25ml萃取溶剂，盖紧试管盖子，置28℃摇床温和混匀10min，取干净吸管吸取上层有机相，放入另一试管，将甲基脂肪酸从水相转移到有机相。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述萃取过程中所用的溶剂是由己烷和甲基叔丁醚以体积1:1混合而成的。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述洗涤过程包括：在试管中加入3.Oml碱性洗涤液，栓紧盖子，震荡试管5min，静止数分钟，分层清晰。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述洗涤过程中采用的碱性洗涤液，是由氢氧化钠10.8g和水900ml组成的混合液。