[发明专利]一种细菌株的同源性快速鉴别方法

权利要求书

1.一种细菌株的同源性快速鉴别方法，包括如下步骤：Ⅰ.根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴别；Ⅱ.利用细菌对糖、蛋白质利用的生化反应进行属或种鉴别；Ⅲ. 利用血清学抗体将细菌鉴别到型；其特征在于，它还包括如下步骤：Ⅳ.采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸的种类与含量，得到该细菌脂肪酸指纹识别图谱，进行同源性比较，将细菌鉴别至株。

2.如权利要求1所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述同源性比较是采用脂肪酸标准品进行同源性比较，所采用的脂肪酸标准品包括脂肪酸甲酯混合物液，含C5～C20直链饱和脂肪酸甲酯及2-羟基-10碳、3-羟基-10碳、2-羟基-14碳、2-羟基-16碳饱和脂肪酸。

3.如权利要求1或2所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，在采用气相色谱技术测量细菌脂肪酸的种类与含量前，将待测菌接种在无脂质成份的培养基上培养，收集菌落，经皂化、甲基化、萃取、洗涤过程，将细菌脂肪酸从水相转移到有机相。

4.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述菌落的收集过程包括：将细菌按四区画线法接种于无脂肪成份的TSBA平板上，35℃、24h培养，用接种环取第三区的菌落40mg左右，置于无菌、干燥、有螺旋盖的试管底部。

5.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述皂化过程包括：在试管中加入1.Oml的皂化试剂，盖紧试管，震荡试管10s，放入100℃沸水中水浴，5min之后从沸水中移出、冷却，震荡10s；再将试管放回水浴中，继续加热25min；沸水中皂化共30min，冷却；所述皂化试剂是由氢氧化钠45g、甲醇150ml和水150ml组成的混合液。

6.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述甲基化过程包括：每管中加入2.0ml甲基化试剂，栓紧试管盖子后震荡10s，置80℃水浴加热10 min，用冷水快速冷却至室温，将脂肪酸转化成甲基脂肪酸；所述甲基化试剂是由6.0 mol/L盐酸 325ml和甲醇275ml组成的混合液。

7.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述萃取过程包括：每管加入1.25ml萃取溶剂，盖紧试管盖子，置28℃摇床温和混匀10min，取干净吸管吸取上层有机相，放入另一试管，将甲基脂肪酸从水相转移到有机相；所述萃取溶剂是由己烷和甲基叔丁醚以体积1:1混合而成的。

8.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述洗涤过程包括：在试管中加入3.Oml碱性洗涤液，栓紧盖子，震荡试管5min，静止数分钟，分层清晰；所述碱性洗涤液是由氢氧化钠10.8g和水900ml组成的混合液。

9.如权利要求3所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述色谱分析过程包括: 将萃取物移至样品小瓶，用干净吸管吸取上层有机相，转移到干净的色谱样品小瓶，置气相色谱仪上；色谱条件：炉温40℃，进样口250℃，检测器300℃；氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min，氮气流量30mL/min；氢气压力10.6psi；色谱柱为Agilent 19091B-102型，检测器为氢火焰离子检测器；脂肪酸标准品定标通过后，加待检细菌样本，采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸种类与相对含量，得到细菌脂肪酸指纹识别图谱。

10.如权利要求1或2所述的一种细菌株的同源性快速鉴别方法，其特征在于，所述同源性比较的判别方法为: 如果两种细菌在所述Ⅰ至 Ⅲ步骤结果相同的情况下，如细菌脂肪酸色谱主峰位置存在明显差异，则提示细菌同属同种但不同源；若脂肪酸色谱主峰位置相同，峰高相近，则提示细菌既同属同种又同源。