[发明专利]一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法，属于微生物遗传工程领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，简称EC)，俗称乌拉坦(Urethane)，分子式为NH₂COOC₂H₅(CAS#51-79-6)。动物毒理学试验显示，EC对多个物种(包括小鼠、大鼠、仓鼠、猴)具有致癌作用，能引起动物肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌等恶性肿瘤的发生，表明EC是人类潜在的致癌物质。1974年，EC被世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)划为2组B类可致癌物质；2007年3月，IARC进一步提高了EC的致癌风险等级，将其划分进2组A类可致癌物质名单。

EC是各种发酵酒精饮料(包括中国黄酒、葡萄酒、日本清酒等)酿造过程中伴随产生的副产物，不少国家尤其是一些欧美发达国家对市场上各酒种中的EC含量制定了严格的限定标准。黄酒是我国特有传统酒种，当前黄酒中EC含量较高的现状已成为严重制约我国黄酒业发展尤其是国际化发展的瓶颈之一，严重阻碍了我国黄酒向国际市场的开拓，同时在高度重视食品安全的今天，对国内消费者也是一个潜在的威胁。因此，研究出适合我国黄酒企业控制EC含量的策略和方法，降低黄酒中EC含量，使其至少与日本清酒国际标准(≤100μg/L)接轨，对于整个中国黄酒业的发展迫在眉睫，具有重大意义。截至目前，我国尚未针对黄酒、葡萄酒等制定EC限量标准，但国家卫生部近两年已开始关注此问题，相信标准的出台只是时间问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌。

本发明提供的低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌，是将脲基酰胺酶基因(DUR1，2)编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPI1转录启动子(TPI1 promoter，简写为TPI1_p)和转录终止子(TPI1 terminator，简写为TPI1_t)控制之下，通过同源重组将TPI1_p-DUR1，2-TPI1_t基因盒稳定整合入菌株黄酒酵母菌株基因组中得到的黄酒酵母代谢工程菌。

所述脲基酰胺酶基因(DUR1，2)的核苷酸序列的GenBank号为NM_001178556。

酿酒酵母组成型高表达TPI1转录启动子、转录终止子TPI1_p来源于大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒pYX212(Invitrogen)。

所述出发菌株黄酒酵母也称为酿酒酵母，购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，菌株保藏号为CICC30395。

本发明的第二个目的是提供上述低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌的构建方法。

本发明提供的构建上述低产尿素的代谢工程菌的方法，是利用代谢工程手段，将脲基酰胺酶基因(DUR1，2)编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPI1转录启动子(TPI1_p)和转录终止子(TPI1_t)控制之下，再通过两端分别连接一段酪氨酸酶相关蛋白1基因(TRP1)同源臂，构建trp1-TPI1_p-DUR1，2-TPI1_t-trp1同源重组基因盒，随后通过同源重组原理将TPI1_p-DUR1，2-TPI1_t基因序列整合入出发菌株黄酒酵母基因组的TRP1位点，使DUR1，2基因获得稳定高水平表达。

所述酪氨酸酶相关蛋白1基因核苷酸序列的GenBank号为NM_001180315。

本发明所述代谢工程菌可以使细胞能及时分解由精氨酸酶水解精氨酸产生的过多尿素，强化尿素降解途径，大大减少酵母细胞的尿素分泌量。小试黄酒发酵试验表明，与出发菌株相比，成功构建的低产尿素黄酒酵母代谢工程菌使发酵液中尿素含量下降至8.5mg/L(下降了～3.3倍)，最终使酒液中的EC含量下降至53.4μg/L(下降了～3.5倍)。本发明的黄酒酵母代谢工程菌株具有明显的产尿素水平低的特点，利用其发酵生产的黄酒EC含量低，且风味基本保持不变。

附图说明

图1是提取的出发菌株黄酒酵母基因组总DNA电泳图(M：Marker；1，2，3：黄酒酵母基因组总DNA)。

图2是PCR扩增DUR1，2基因电泳图(M：Marker；1，2：DUR1，2基因)。