[发明专利]甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物检测技术，具体的说涉及甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法。 

背景技术：

甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)是从甘蔗花叶病植株上鉴定出的一种新型病原，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)一个新属——禾本科病毒属(Poacevirus)，是引起甘蔗花叶病的一种重要致病病原。目前世界上仅有印度、巴基斯坦、美国、泰国、斯里兰卡、越南以及印度尼西亚有过报道。我国国内对该病毒研究不是很多，仅有在广东某甘蔗基地内从引自印度的甘蔗种质资源上发现该病毒的报道。但是近年来，由于蔗糖产业科技和生产的发展与需求，我国各蔗区相继从境外和国内其它蔗区频繁引入了大批甘蔗品种及种质材料，在对甘蔗进行品种改良和种质创新的同时，也增加了像甘蔗条纹花叶病毒类危险性病害扩散的风险。如果对引种的甘蔗种质资源未检疫或检疫不到位，极有可能造成该病毒在我国蔗区内扩散，给我国蔗糖产业的可持续发展造成潜在威胁，因此建立该病毒的快速检测方法是阻截此危险性病毒扩散的重要措施。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法，用于甘蔗条纹花叶病毒RT-PCR检测的引物序列及其检测方法能够满足需要。 

本发明通过分析已报道的甘蔗条纹花叶病毒的CP基因保守区序列，设计引物。所述的引物对由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SCSMV-F&SCSMV-R所示。正向引物的核苷酸序列为：SCSMV-F：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′，反向引物的核苷酸序列为：SCSMV-R：5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′，目的条带大小为938bp。 

本发明还进一步给出了应用上述引物的RT-PCR检测方法，该方法以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，转录合成cDNA，反应结束后根据特异性扩 增的938bp DNA片段的位置判定结果。 

RT-PCR扩增过程如下： 

RT的反应体系为10ul，即在0.2ml的PCR反应管里加入2.5ul的灭菌双蒸水、2.0ul 5×反转录酶缓冲液、1.0ul DNTP、反向引物SCSMV-R 0.5ul(20um/ul)、0.5ul RNA酶抑制剂、0.5ul反转录酶、3ul总RNA，混匀。反应程序为25℃10min、42℃60min、98℃5min，结束后获得反转录产物cDNA。 

PCR反应体系25ul，即在0.2ml的PCR反应管里加入9.5ul的灭菌双蒸水，2.0ul cDNA、正向引物SCSMV-F和反向引物SCSMV-R各0.5ul(20um/ul)、12.5ul的2×PCR Taq mix；反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。 

进一步，还可以将上述本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。 

本发明根据甘蔗条纹花叶病毒的CP基因保守区序列设计引物，用于甘蔗条纹花叶病毒的RT-PCR检测，通过对反应体系和反应退火温度的优化，建立了甘蔗条纹花叶病毒的RT-PCR检测方法，反应结束后即可根据特异性扩增片段的位置判定样品中是否含有甘蔗条纹花叶病毒。本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速简单、可用于大量甘蔗样品的检测，为甘蔗引种检疫和甘蔗条纹花叶病毒在我国蔗区的传播动态监测提供了保证。 

附图说明

图1是甘蔗条纹花叶病的RT-PCR检测结果，其中M为D2000plus DNA ladder，1为SCSMV阳性对照，2为SCMV阳性对照、3为SrMV阳性对照，4为健康植株。 

图2是本发明检测大量样品的试验结果，其中M为D2000plus DNA ladder，1-8为田间采集样品，9为SCSMV阳性对照，10为健康植株。 

具体实施方式

下面实施例子用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1引物的设计和合成 

根据GenBank数据库中已报道的甘蔗条纹花叶病毒基因组序列和外壳蛋白基因的保守序列(登录号Y17738)，采用Premier 5.0设计引物，引物序列为： 

SCSMV-F(正向)：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′ 

SCSMV-R(反向)：5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′