[发明专利]一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用

说明书

技术领域

本发明属基因芯片技术领域。具体涉及一种检测应答水稻白叶枯病的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。

背景技术

水稻白叶枯病是仅次于稻瘟病的第二大世界性水稻病害，它的病原菌是黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)，因此，在现有基因芯片先进技术的基础上，研究出一种适宜认识抗水稻白叶枯病的基因分子基础，发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，抗水稻白叶枯病的表达谱，分析抗病相关基因在病原菌处理前后的表达，抗水稻白叶枯病的机制研究的基因芯片的制备方法及其基因芯片，对培育高抗水稻白叶枯病的水稻新品种具有重要意义。

基因芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。目前基因芯片技术以其快速、高通量、大规模、高度自动化、高度并行性、高灵敏度等优点，已经在大规模DNA测序、基因表达分析、基因型筛选、基因突变及多态性检测、疾病的诊断及治疗、药物筛选、新基因的发现克隆及功能研究等领域得到了广泛的应用。

基因芯片按所点DNA的种类不同可分为两种：寡核苷酸微阵列和cDNA微阵列。寡核苷酸微阵列是指主要利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制备成高密度的寡核苷酸阵列，寡核苷酸的长度随芯片用途不同而不同，但一般在50 bp以内，以8～25 bp为多。寡核苷酸微阵列密集程度高，一致性和可重复性好，但费用高、灵活性差，主要用于DNA序列测定、SNP分析等，也可用于表达谱研究。cDNA 微阵列是指利用点样法制备的较低密度的玻片或尼龙膜芯片，芯片上固定的探针主要是cDNA 片段。cDNA微阵列对靶基因检测的特异性好，技术相对简单、灵活性高，但重复性稍差，主要用于表达谱研究。根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因芯片的制作方法主要有两种，一是Affymetrix公司采用的原位合成法，二是将PCR得到的cDNA、寡核苷酸片段等直接点样，又叫合成后点样。对于基因组序列己知的生物，可以直接根据序列设计全基因组基因芯片。用Array Designer软件设计引物，在合成DNA片段前用序列同源性搜索软件分析，保证扩增片段不与基因组其它序列杂交，通过PCR可以扩增获得代表每个ORF的DNA片段，经纯化后可以点到玻片上。而对于基因组序列未知的生物，可以用DNA文库制备基因芯片。

基因芯片技术已被广泛应用于基因差异表达检测，也被逐渐用成植物抗病机理研究手段。用基因芯片检测表达谱，能提供大量信息有助于阐明防御应答网络，可分析评价多种防御途径之间的交流，利于对抗病机制的了解和抗病候选基因的筛选。已有的基因芯片技术研究水稻抗病机制中，是以水稻基因组相关基因制作芯片，提取病原物侵染后水稻叶片组织的RNA，反转录成cDNA后再与芯片杂交、分析。但现有技术的cDNA 微阵列的制备上还存在cDNA片段仅来自cDNA文库，使芯片中的cDNA质粒类型单一，不能全面反应待检测对象相关的基因的缺陷和不足，也还缺少一些重要材料如能免疫水稻白叶枯病的疣粒野生稻在应答水稻白叶枯病原菌处理（胁迫）后的cDNA 微阵列基因芯片，制约了全面深入认识、研究水稻抗白叶枯病的基因分子机制。

疣粒野生稻（Oryza meyeriana）对水稻白叶枯病具有高度的抗病性，彭绍裘等用湖南白叶枯病强菌系对云南普通野生稻，药用野生稻，疣粒野生稻进行检测，发现疣粒野生稻抗性水平达到免疫级（彭绍裘等，“野生稻多抗(病)性鉴定——高抗白叶枯病的抗源-疣粒野生稻”，《湖南农业科学》 1981年05期 ），章琦等鉴定了三种野生稻对水稻白叶枯病的抗性，参试的13个野生稻种共871份材料，抗性测定结果表明：多数野生稻种具有抗性优良的资源，就抗性水平而言，以疣粒野生稻最为突出，参试的疣粒野生稻全部高抗，整个生育期都表现高抗，甚至免疫（章琦,“ 水稻白叶枯病抗性的遗传及改良”。 科学出版社 2007年9月，北京第1版。），因此，进一步利用疣粒野生稻为材料制备应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，对发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，研究疣粒野生稻抗水稻白叶枯病的机制，对于选育抗白叶枯病的水稻新品种具有重要意义和应用前景。

发明内容