[发明专利]一种转基因棉花检测通用质粒标准分子及其构建方法

权利要求书

1.一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子含有棉花内标准基因sadI，抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子序列。

2.一种如权利要求1所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)通过GenBank数据库和文献查询，获得棉花内标准基因SadI，抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子的核苷酸序列；

(2)根据获得的目的基因的核苷酸序列，设计引物，PCR获得目的基因片段；其中，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对扩增抗虫棉获得棉花内标准基因sadI，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CPTI，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8组成的引物对扩增抗除草剂棉花获得抗除草剂基因CP4，SEQ ID NO9和SEQ ID NO10组成的引物对扩增抗虫棉获得Nos终止子序列；

(3)将步骤(2)获得的棉花内标准基因SadI PCR产物与T-载体连接形成中间载体pGhsadI；

(4)采用Overlapping PCR技术，以步骤(2)获得的抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因和抗虫基因CPTI的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CryIAb/CryIAc-CPTI融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCPTI-Bt；

(5)采用Overlapping PCR技术，以步骤(2)获得的抗除草剂基因CP4和Nos终止子部分序列的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CP4-Nos融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCP4-Nos；

(6)采用EcoR1和Kpn1双酶切载体pCAMbia2300和中间载体pCPTI-Bt，分别回收8742bp和1222bp的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CB；

(7)采用HindIII和salI双酶切中间载体pGhsadI和p2CB分别回收824bp和9964bp的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CBS；

(8)采用BamHI和SalI双酶切中间载体pCP4-Nos和p2CBS，分别回收1584bp和10808bp的DNA条带，经连接酶连接后形成质粒标准分子pMCS。

3.根据权利要求2所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于，所述载体pCAMbia2300包含标记基因Kan和调控序列35S启动子。

4.根据权利要求2所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于，所述抗虫棉为转基因棉花GK312。

5.权利要求1所述转基因棉花检测通用质粒标准分子在检测转基因棉花中的应用，其特征在于，采用所述质粒标准分子为模板，做定性PCR检测，扩增出与棉花内标准基因sadI，抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子序列。