[发明专利]一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法

说明书

技术领域

一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，属于食品酶工程技术领域。

背景技术

低聚果糖（Fructooligosaccharides），简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n=1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由蔗糖和1～3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。工业上一般由蔗糖经果糖基转移酶(Fruetosyltransferase，EC 2.4.1.9，FTS)的转糖基作用而生成低聚果糖，其酶促反应机理如下：

低聚果糖（FOS）是一种功能性低聚糖，其特点是低热量、低甜度，可以促进矿物质吸收、改善肠道菌群、抗龋齿、降血脂等，其作为功能性因子被广泛应用于食品中，如奶制品、饮料、糖果糕点、肉类加工品等。目前国内工业化生产FOS的技术多为液体深层发酵法，该法的缺点是产酶菌丝体只能利用一次，在FOS生产过程中，由于菌丝体及其培养基成分的存在并参与反应，使整个工艺繁杂，成本高。将酶固定化以后可以提高酶的使用效率，降低生产成本，传统的固定化方法有包埋法、吸附法、交联法等，但这些方法都有一定的不足之处，固定化效率低、酶分子容易泄漏、操作稳定性低等。

有序介孔分子筛是一种近年来研究比较多的分子材料，由于其孔道规则，结构有序，热稳定性好，且拥有较高的比表面积以及较强的吸附能力，其孔道中可组装多种物质而改变理化性能。因此，有序介孔材料在多相催化、大分子吸附及酶的固定化方面上应用广泛。近年来，MCM-41，MCM-48和SBA-15等有序材料在生物化学领域的应用逐渐受到关注。已有文献报道了以介孔分子筛作为生物大分子固定的新型载体，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶等，获得了较好的固定化效果。并其中SBA-15是一种孔道结构的分子筛，其孔道直径在5-30nm可调，无生理毒性，稳定性好，其表面有大量的羟基，可以吸附酶蛋白，可应用于酶的固定化，但是单独依靠吸附作用结合的酶容易泄漏，稳定性差，因此还需其他步骤改进。

壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是一种天然高分子生物材料，生物相容性较好、易生物降解，且无毒、廉价易得。其结构由大部分2-氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖单元和少量N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元以β-1，4糖苷键连接形成，相对分子质量为几十万到上百万左右。壳聚糖分子中的羟基和氨基可以通过离子键、氢键及范德华力而吸附蛋白质，通过壳聚糖吸附法固定化酶应用广泛。壳聚糖本身也是一种多孔的网状结构，因此可以将吸附了蛋白质的SBA-15再与壳聚糖结合，使固定化颗粒再次吸附在壳聚糖的网状结构中，达到双重吸附固定化酶。但是仅靠吸附作用固定化酶蛋白，酶分子容易脱落，因此可以加入双功能基团试剂，如戊二醛等，进一步交联。由于壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂很容易与酶发生间接共价结合，此外酶与酶之间也可以通过这种双功能试剂进一步交联，使酶分子更稳固地固定在载体上。

本发明即通过上述双重吸附-交联法固定化果糖基转移酶得到固定化颗粒，经研究证明该方法步骤简单易操作，条件温和，且可以获得较高的酶活回收率、蛋白吸附率、重复利用率以及稳定性，可用于高纯度低聚果糖的生产，具有一定的实际应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种以介孔分子筛为载体材料固定化果糖基转移酶的方法，该方法操作简单，所得蛋白吸附率和酶活回收率较高，酶活回收率可达75%以上，蛋白吸附量可超过350mg蛋白/g SBA-15，其pH稳定性与温度稳定性都优于游离酶，固定化酶重复利用10次后酶活仍保留70%以上，该固定化酶在4℃条件下储存60天后酶活仍保持的85%以上。

本发明的技术方案：一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，先以介孔分子筛SBA-15为载体，将酶蛋白吸附于该载体上，再加入壳聚糖以及双功能试剂戊二醛进一步吸附并交联，通过两步吸附-交联法进行了果糖基转移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于载体上，步骤如下：

（1）载体吸附酶蛋白：将总酶活300-400U果糖基转移酶用18mL 50mM、pH 5.0-7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液稀释，再与30-50mg的介孔分子筛SBA-15混合后，置于恒温振荡器中，室温下以恒定转速振荡吸附2-6h；