[发明专利]一种抑制芸苔根肿菌的解淀粉芽胞杆菌及其活性物质的分离与应用

权利要求书

1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于命名解淀粉芽胞杆菌HB-26，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日2011年7月18日，保藏中心编号CCTCC NO.M2011259。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于菌体大小为0.4～1.0umx1.0～1.5um，细胞呈短杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运动，在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落椭圆形、表面隆起有皱褶，最适生长温度为30℃，pH6-8生长。

3.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于菌体在pH7.0-7.2生长。

4.一种权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌的培养方法，其特征在于具体步骤如下：

1)将沼液进行分离培养与保存

称取0.1g土样及1ml沼液，分别加入灭菌去离子水至总体积为10ml，混匀后再依次取1ml，继续稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀释后的菌液200μl涂布LB平板，30℃培养过夜，分别挑取单菌落，转接入5ml LB液体培养基中，200rpm 30℃活化8-10h，用25％甘油保存在-80℃，

LB平板配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂粉20g；补充水分至1L，pH 7.2，121℃灭菌30min；

2)细菌的小量发酵

将活化过夜的细菌单菌落按1％的接种量转接于100ml LB液体培养基中，200rpm30℃振荡培养24-36h，

LB液体培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，补充水分1L，pH 7.2，121℃灭菌30min；

3)抑菌活性检测的白菜根肿病盆栽实验

(1)将大白菜种子用温水浸泡过夜，用70％酒精洗一遍，点播在装有培养土的培养钵中，每钵放2颗种子，在20℃温室中避光培养14d，每天浇水一次，模拟自然条件培育；

(2)将生长至3-4叶片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分为混入芸苔根肿菌的病土及没有病原菌的健康土两种，每个处理设置5次重复，20℃培养，每天浇水一次；

(3)每2个星期灌根一次，共灌根3次，每次用100ml步骤2)的菌液灌根，傍晚灌根；

(4)2个月后，将白菜根部拔出，根据没有根肿的植株找出对应灌根所用的菌株，即为对根肿菌有抑菌活性的菌株。

5.一种从权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌分离对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的方法，其特征在于具体步骤如下：

1)HB-26菌株的发酵与活性物质提取

LB液体培养基中接种HB-26，过夜培养，第二天转接至20L发酵罐中，进行12L LB培养液的小量发酵，30℃培养，溶氧量20％-30％，通气量1∶0.3-1∶0.5，转速从200rpm-300rpm，pH 6.5-7.0，发酵24h后，取出发酵液，倒入冻干槽中，每槽状菌液量为100ml，冻干机中冻干2-3天后，将冻干粉从冻干槽中取出装入三角瓶中，每6个冻干槽的菌粉装入1个三角瓶，每个三角瓶中加入100ml乙酸乙酯，混匀后室温180rpm振荡1h，取上清液加入旋转蒸发仪中进行旋转蒸发，得到干粉，加入100％甲醇溶解；

2)HB-26菌株活性物质的分离

取5ml甲醇溶解的样品进行HPLC分离，所用色谱柱为反相柱，10μm，10×250mm，进样体积800μl，柱温为25℃，流速7.5ml/min，流动相为乙腈和水，采用梯度洗脱，乙腈的浓度在25min内5％变至100％，每分钟收集一个组分，共收集到36个组分；

MS鉴定分离组分的分子量，质谱检测条件：电喷雾电离，毛细管电压为3.5KV，锥孔电压为45V，离子源温度为100℃，干燥温度为300℃，脱溶剂气体流速500L/h，锥孔气体流速为50L/h；

3)用盆栽实验验证活性成分，

盆栽实验依然采用上述条件，每个处理设置两棵植株，根据白菜根肿发作的情况，来判断活性物质为哪一个组分，结果显示对白菜根肿病具有抑制效果的是组分17、20、30分钟收集的组分。

6.根据权利要求5所述的从解淀粉芽胞杆菌分离对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的方法，其特征在于分离出的抑菌活性物质命名为BA20，是糖类衍生物，分子量为1494.0。

7.一种由权利要求5所分离的对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的用途，其特征在于用作制备防治白菜根肿病的微生物制剂。