[发明专利]核糖核酸酶的检测方法及其应用和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学及分子诊断领域，具体而言，涉及一种受试者体液中核糖核酸酶的检测方法、该方法在肿瘤检测中的应用以及一种肿瘤检测试剂盒。

背景技术

早期诊断是疾病尤其是肿瘤治疗中的一个关键环节。通常，人们通过测量血液中的每种肿瘤对应的物质(通常被称为肿瘤标志物)来检测各种肿瘤。所述的肿瘤标志物可定义为“在癌细胞产生的物质中或是在因体内正常细胞与癌细胞相互作用而产生的物质中，可通过对血液、组织和排泄物(尿液和粪便)等进行检查从而用作为癌症诊断或治疗的标志物的物质”。

核糖核酸酶或称RNA酶，是一大类包括数十个种类的、能够将RNA底物水解成小分子核酸的酶。1958年，Miliarese首先提出血清RNase浓度与恶性肿瘤有密切关系。1970年，Reddi首次证实胰腺癌患者血清RNase异常升高(Reddi KK，Holland JF.Elevated serum ribonuclease in patients with pancreatic cancer.Proc Natl Acad Sci USA.1976，73(7)：2308-10)。在胰腺癌诊断中，应用最多的是测定血清RNase的浓度，这是由该酶的组织来源的和在血清中的高浓度所决定的。实验证明，RNase酶在胰腺和血清中的含量比其他组织器官高100倍以上，而且血清中提取的RNase在生物化学和免疫学特性与胰腺来源的RNase非常类似，并且均可被RNase抑制剂所抑制。这些相同的特性表明，血清中的RNase主要来源于胰腺。

为了检测样本中核糖核酸酶的活性或含量，研究人员在分析底物降解的基础上，建立了许多技术方案。早期的核糖核酸酶活性检测是建立在Kunitz技术上(Kunitz M.A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity.J.Biol.Chem.，1946，164：563-568)。在该技术中，他们向被检测样本中加入异质性的RNA样本，通过分光光度法检测RNA样本在300nm吸收值的变化，计算样本中核糖核酸酶的活性。除了以异质性的核糖核酸分子为底物，另一类核糖核酸酶检测方法是以人工合成的核糖核酸分子为底物，例如寡聚核糖核酸分子。通常情况下，以人工合成的寡聚核糖核酸分子为底物的检测技术具有更高的灵敏度和更好的特异性。其中的代表性技术是1991年由Witmer等人建立的(Witmer MR，Falcomer CM，Weiner MP，Kay MS，Begley TP，Ganem B and Scheraga HA.U-3′-BCIP：a chromogenic substrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems.Nucleic Acids Res.，1991，19：1-4)。该技术的主要特点是合成了核糖核酸酶底物U-3′-BCIP，该底物在核糖核酸酶的作用下会释放一种报告基团，利用分光光度计在650nm条件下检测报告基团的释放情况，从而计算样本中核糖核酸酶的活性和含量。这些不同的技术方案以及他们的改进方案虽然在一定程度上提高核糖核酸酶活性检测的灵敏度和准确性，但均存在一定的缺陷，不适合作为一个通用的研究手段用于样本核糖核酸酶活性的高通量检测，在技术上还有较大的可改进的空间。

综上所述，本领域迫切需要一种灵敏而特异的基于核糖核酸酶的疾病诊断尤其是肿瘤诊断标志物、以及相应的检测技术。

发明内容

为了开发可用于人类疾病尤其是肿瘤早期诊断的生物标志物、以及相应的检测技术，提高人类疾病尤其是肿瘤检测的灵敏度和特异性，发明人对核糖核酸酶降解双链核糖核酸底物的过程及机制进行了广泛而深入的研究，意外地发现绝大多数降解发生在双链核糖核酸底物的两个敏感位点CA/UG和UA/UA位点上。在这一研究结果的基础上，完成了本发明。

一方面，本发明提供了一种核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：1)从受试者个体中获得体液样本；2)使所述体液样本与双链核酸接触，使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)检测步骤2)中的接触后的产物，从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量；

其中，所述体液样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种；