[发明专利]一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，用于快速检测患者血液样品中丙型肝炎病毒的型及亚型，属于医疗器械领域。

 

背景技术

丙型肝炎病毒（hepatitis C virμs, HCV）是一种单股线性正链RNA病毒，是重要的肝病致病因子之一，严重威胁人类健康。目前全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV感染患者发展为肝癌，继而引起消化道出血和腹水。肝病患者中由HCV感染导致的死亡正逐步增多。

丙型肝炎病毒包括9400左右个氨基酸，HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，编码一具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV基因组中各种基因结构和功能不同，有些区域高度保守，如5’非编码区，非结构区。HCV具有高度的变异性，本身又具有负选择作用，导致了HCV基因分型众多，目前已知HCV至少可分为6型（HCV1-6型），各型又分为许多亚型（如1a, 1b, 2a, 2b, 3c等 ），共70多种亚型。各型核酸序列之间相差31-34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差20-23%。不同型别的HCV对治疗药物如干扰素、利巴韦林的敏感程度不同，区别患者的HCV基因型对临床治疗用药非常有帮助。

目前对HCV基因分型的方法主要有：ELISA法，荧光定量PCR法，限制性片段长度多态性，型特异性探针核酸杂交分析法等。这些方法敏感性、特异性低，只能区分出主要的几种基因型，对亚型分型能力不足，不能满足临床需求。

 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、敏感地检测HCV基因型的试剂盒。

由于同一基因型、不同亚型HCV5’非编码区序列的差异度仅为1%-3.3%，而NS5B基因序列的差异度为16.5%-20.1% ，NS5B基因更适合用于HCV的基因分型。因此，根据HCV NS5B区基因序列而进行的基因分型被公认为HCV基因分型的“金标准”。

 

本发明为了提供对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，首先设计了HCV NS5B基因引物。HCV NS5B基因上游引物序列为：

5’ -TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3’（SEQ ID No.1）

HCV NS5B基因下游引物序列为：

5’-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3’ （SEQ ID No.2）

同时设计了HCV NCR保守区域基因引物：

HCV NCR保守区域基因上游引物序列为：

 5’-GCGGAACCGGTGAGTACA-3’ （SEQ ID No.3）

HCV NCR保守区域基因下游引物序列为：

5’-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3’ （SEQ ID No.4）

本发明提供的对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，包括HCV NS5B基因扩增引物、HCV NCR保守区域基因扩增引物、HCV RNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，

HCV NS5B基因上游引物序列为：5’ -TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3’

HCV NS5B基因下游引物序列为: 5’-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3’

HCV NCR保守区域基因上游引物序列为:  5’-GCGGAACCGGTGAGTACA-3’

HCV NCR保守区域基因下游引物序列为: 5’-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3’

其中HCV RNA提取采用酚氯仿提取法提取，提取试剂为：TRIzol，氯仿、异丙醇、无水乙醇和无RNase去离子水。

其中的阴性对照和阳性对照，以去离子水为阴性对照，以已知型别的含有HCV样品为阳性对照。

其中的cDNA合成反应液包括：200 U/μL 逆转录酶(M-MLV)、40 U/μL RNase抑制剂、50 μM Oligo(dT)₁₅、50 μM 随机引物(Random primer)、5×第一链合成缓冲液(first-strand buffer)、 无RNase的去离子水(RNase-free ddH₂O)、10 mM dNTPs。