[发明专利]一种MICB基因分型的PCR-SBT方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及用于人类MHC-I类链相关基因B位点(MHC class Ichain-related gene B，MICB)的扩增和分型方法，以及所述方法配套的试剂盒。

背景技术

MHC-I类链相关基因(MHC class I chain-related gene，MIC)，位于人6号染色体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因区域中，长度为2Mb，所编码蛋白质分子是NK细胞、γδT细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的活化性受体NKG2D所识别的重要配体。目前已发现有7个MIC基因位点，仅MICA、MICB为功能基因，分别位于着丝粒46kb和140kb位置处，靠近HLA-B位点三者高度连锁不平衡。MICB基因具有广泛的多态性，存在多个基因型。根据编码MICB分子胞外区的外显子2～5基因序列的差异，发现了31个MICB等位基因。MICB基因编码蛋白MICB分子作为NKG2D配体参与多种感染免疫的过程，大量研究表明MICB基因多态性与多种疾病的易感相关，同时也是导致移植排斥的重要因素。当前MICB基因的分型尚无广泛普及，且无相关的商品试剂。

另一方面HLA分型技术已广泛应用于多个领域，如HLA多态性的研究、HLA的生物学功能、器官和骨髓移植前供受者组织相容性配型、HLA与某些疾病的关联、亲子鉴定以及人类遗传学等方面。HLA分型技术主要由血清学分型技术、细胞学分型技术、基因分型技术等。个体的HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞血分型。目前以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞血分型技术。基因分型方法具有独特的优点：需要的血样少，标本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。特别重要的是基因分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法，基因分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。

目前国际上标注的HLA分型技术有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(聚合酶链式反应产物直接测序分型)。

PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide)：也称PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片段产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于MICB等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品进行多次杂交(甚至十几次)才能完成定型分析操作也十分繁琐，于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法(reverse hybridization)。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因的分析。此方法具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件必须严格统一(如温度、离子浓度)，容易出现误差；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级；对某些杂合子分辨率也不好。很多基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式的不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存(三种效果比较)。

PCR-SSP：PCR-SSP方法用预先设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer，SSP)，借助PCR技术获得MICB型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定MICB型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行，分辨率可从低到高，成本低。缺点是不易自动化；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成像仪保留原始资料，增加实验成本(三种效果比较)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂(引物)，且不能识别新基因和假基因。针对目标序列外显子和内含子序列精细设计引物可避免这些问题。

PCR-SBT：以PCR扩增所要分析的基因片段，然后对DNA序列进行分析，可直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。因此，应用SBT技术进行高分辨率基因分型是目前国际上公认的基因分型金标准。目前市面上尚无MICB基因分型试剂。

发明内容