[发明专利]一种MICB基因分型的PCR-SBT方法及试剂盒

权利要求书

1.一种MICB基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外显子及之间的内含子；

所述的扩增引物对为MICB-F和MICB-R

MICB-F：5’-GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’

MICB-R：5’-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’；

所述PCR扩增反应条件依次为：

1)95℃5min；

2)重复以下19个循环：

94℃45s→65℃45s，每循环降低0.5℃→72℃2min；

3)重复以下13个循环：

94℃45s→55℃45s→72℃2min；

4)72℃10min；

5)4℃保持；

所述PCR反应体系为20μl，其组成如下：

浓度4ng/μl的DNA 10μl

1.49μl PCR缓冲液，所述的PCR缓冲液配制方法：10ml PCR缓冲液含：0.8g氨基丁三醇，0.22g硫酸氨，0.67ml 1M氯化镁，用盐酸调节pH到8.8；

1.49μl 5mM dNTP；

0.5μl 10μM上游引物MICB-F；

0.5μl 10μM下游引物MICB-R；

0.49μl 10％牛血清蛋白；

5.32μl 28％蔗糖/甲酚红染料；

0.12μl 5U/μl TaqDNA聚合酶；

加双蒸水补足体积；

(2)、使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，然后对扩增出的各序列进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果；

所述的用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物；

MICB-CF1：5’-GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’

MICB-CR2：5’-CCCTGTGCTATGGATGCA-3’

MICB-CF3：5’-CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3’

MICB-CR4：5’-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述测序反应体系为10μl，其组成如下：

2μl PCR产物；

3μl Big Dye测序缓冲液；

1μl Big Dye测序末端；

0.25μl 10μM的测序引物；

3.75μl双蒸水；

所述测序扩增反应条件依次为：

1)重复以下24个循环：

96℃10s→50℃5s→60℃4min；

2)4℃5min。

3.一种权利要求1所述的方法配套的试剂盒，其特征在于，包括扩增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外显子及之间的内含子的引物：

MICB-F：5’-GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’

MICB-R：5’-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’；

以及用于测序分析的4条引物：

MICB-CF1：5’-GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’

MICB-CR2：5’-CCCTGTGCTATGGATGCA-3’

MICB-CF3：5’-CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3’

MICB-CR4：5’-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。