[发明专利]基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物寄生线虫检测技术领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)的试剂盒及其应用。

背景技术

甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)，又称甘薯茎线虫或腐烂茎线虫，最早被发现于马铃薯上，导致马铃薯腐烂，因此也被称为马铃薯腐烂茎线虫(Potato rot nematode)。甘薯腐烂茎线虫是一种迁移性植物内寄生线虫，主要危害植物地下部，尤其是块茎和球茎等。甘薯腐烂茎线虫寄主范围非常广，已知的寄主有120多种，受害最重的是马铃薯、甘薯等块茎作物和一些球茎花卉。甘薯腐烂茎线虫是农业生产上重要的植物寄生线虫，也是我国和许多其他国家和地区的检疫性危险线虫。

我国是世界上甘薯的主产国，常年甘薯种植面积在600万hm²左右，占世界总面积的70％左右。甘薯我国许多省区农业产业结构调整中的优势作物，正逐步向效益型经济作物转变。目前，甘薯茎线虫病已成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，近年来业已上升为北方薯区最严重的病害，一般发病田块减产20％-50％，重病田块基本上绝产无收。如何控制腐烂茎线虫的危害，提高甘薯种植效益，成为当前亟待解决的问题。

对甘薯腐烂茎线虫的快速检测技术是防治此病的重要方法。有效的预防和控制甘薯茎线虫病的传播和蔓延对于确保我国农业生态环境的安全，保证我国农产品出口符合进口国植物检疫要求，以及保证进境种苗和农产品的安全，有效抵御外来有害生物入侵都有着重要的作用。

近年来一些依据形态学特征所进行的多歧分类和数值分类法提高了对某些线虫类群鉴定的准确性。但是由于线虫许多表型特征的保守性，再加上寄主及环境条件的差异，因此线虫在种内也存在着一定的变异范围，而且有的线虫种间的形态测量值又存在重叠的现象，因此以传统的形态学和鉴别寄主反应为基础的分类法不仅主观、繁琐，而且难以可靠地分析和鉴别近似种间、种内生理小种或致病型间存在的差异。而且鉴定所需时间很长，甚至还要经过作物的一个生长季节才能得出结果，这对于现时的经济模式，尤其是检验检疫来说是难以接受的。

有鉴于此，近年来，植物线虫学家尝试发展了甘薯茎线虫的分子检测技术。如利用PCR-RFLPs技术对茎线虫属里三个重要的相似种腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、食菌茎线虫(D.myceliophagus)和鳞球茎线虫(D.dipsaci)7个不同寄主族进行了区分(Karen，1993)。如利用ITS-PCR区分甘薯腐烂茎线虫的A型和B型群体。这些方法和传统手段相比，更为迅速可靠，没有季节、虫态和数量的限制。然而，以常规PCR为基础的分子检测，需要相对高质量的线虫DNA模板，扩增和检测需要多个仪器设备，且整个过程需要数个小时，对于需要快速通关的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，需要开发新型的、快速、简便、可靠且低成本的甘薯腐烂茎线虫检测手段。

已发现我国危害甘薯的马铃薯腐烂摹线虫rDNA-ITS基因片段长度存在A型(900bp)和B型(1100bp)2个类型，A型腐烂茎线虫群体的ITS片段比B型群体少200bp。这两种类群的划分，通过对28S rDNA-D2/D3区系统分析得到了证实(于海英，彭德良，胡先奇，黄文坤马铃薯腐烂茎线虫28S rD NA-D2/D3区序列分析。植物病理学报，2009，39(3)：254-261)。