[发明专利]一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，属转基因生物安全性评估和微生物生态学领域。

背景技术

自1983年世界上首例转基因植物获得成功以来，利用基因工程对农作物进行改良和优化后在提高产量、改善农产品营养成分、缩短育种周期、增强抗病虫性等方面均取得了巨大成就。许多转基因作物如玉米、棉花、大豆等已经进入了商业化生产。然而这些转入了外源基因的作物是否会给人们带来不可预料的风险却备受争议，转基因作物的安全问题也是目前国际社会关注的热点。

土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤生态系统的稳定与否直接关系到赖以其生存的作物的生长和发育，并最终影响到整个农业系统的稳定性。土壤生态系统中蕴含着极其丰富的微生物群落，参与土壤中诸多生物化学过程、营养物质循环、有机物的分解转化等，是土壤养分转化及有机物质分解的基础。土壤微生物在生态系统中起着举足轻重的作用，是土壤生态系统的重要组成部分，其多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础，因此，评价转基因作物对土壤微生物数量、群落结构及功能的影响具有重要的生态学意义。

目前，国内关于转Bt基因水稻对根际土壤微生物群落结构影响的研究主要采用传统的微生物培养方法，误差极大，远不如分子生物学方法准确、简便、直观。变形梯度凝胶电泳(DGGE)技术因稳定性强，重复性好，灵敏度高，能提供群落中优势种群信息并且可同时分析多个样品等优点，被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。目前国内外关于运用PCR-DGGE技术进行转Bt基因作物对根际土壤微生物安全性评价的报道较少，建立适用于评价转Bt基因作物对根际土壤微生物群落结构影响的PCR-DGGE技术，对于完善转基因作物土壤生态安全评价技术体系至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、稳定、直观的应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，以解决传统培养方法工作量繁重、误差大、不全面、分辨水平低等问题，从而将PCR-DGGE技术成功应用于转基因作物对根际土壤微生态安全性评价中。

本发明根据植物根际土壤特性，结合土壤微生物多样性研究方法，摸索出一种适用于评价转基因作物根际土壤微生物群落影响的PCR-DGGE技术体系，该技术可以不经过培养而直接提取根际土壤微生物基因组总DNA。DNA分子的种类及相对比例可以反应土壤样品中微生物种群的数量及相对比例，使在获得的DGGE图谱中，每一条带可以代表一种微生物的基因组DNA片段，即条带信息反应该样品微生物群落组成，这样根际土壤微生物群落结构信息就被间接的记录在DGGE图谱上，分析该图谱并结合聚类分析就可以比较分析转基因作物对根际土壤微生物群落的影响。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

本发明所述的应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，具体包括以下步骤：

1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因作物的根际土壤样品，进行基因组DNA提取

通过采用酶裂解、化学裂解并结合反复冻融裂解法，以及重复氯仿、异戊醇抽提步骤，有效提高了细胞裂解效率和DNA得率，并减少了土壤中腐植酸、有机分子等杂质对核酸提取和PCR扩增过程的抑制作用，提高了所得DNA的纯度。

其中，所述的生育期包括苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、成熟期；所述的转基因作物优选转Bt基因作物，更优选转Bt基因水稻。

2)分别用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的各基因组DNA片段进行PCR扩增，扩增程序采用降落PCR

由于DGGE电泳要求在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段，扩增所用一条引物的5’-端含有一段约40bp的GC夹子，其退火温度较高，使得使用常规的PCR扩增方法效率较低。因此，本发明设计了一种降落PCR扩增方法，即以高于退火温度10℃的温度为起点，每个循环降低0.5℃，反应20个循环后温度降为退火温度，在此退火温度下再进行15个循环，从而大大提高了PCR扩增质量及扩增效率。

具体来讲，本发明采用种群特异性引物，即细菌引物对341f-GC/518r、真菌引物对NS7-GC/NS8、放线菌引物对R513-GC/F243分别针对性的研究了不同生育期转Bt基因和非转Bt基因作物根际土壤中主要的三大类微生物群落的结构。

其中细菌引物对序列如下：