[发明专利]一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术

权利要求书

1.一种应用于转基因作物根际土壤微生态安全性评价的PCR-DGGE技术，其特征在于，包括以下步骤：

1)收集不同生育期的转基因作物、非转基因作物的根际土壤样品，进行基因组DNA提取；

2)分别用细菌、真菌、放线菌的特异性引物对对上述提取的各基因组DNA片段进行PCR扩增，扩增程序采用降落PCR；

3)DGGE电泳分离得指纹印记图谱；

4)对图谱进行数字化处理及UPGMA聚类分析。

2.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、成熟期。

3.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述转基因作物优选转Bt基因作物。

4.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，采用酶裂解、化学裂解并结合反复冻融裂解法，以及重复氯仿、异戊醇抽提步骤，进行基因组DNA提取。

5.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述细菌、真菌、放线菌的特异性引物对序列如SEQ ID No 1～6所示。

6.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述降落PCR扩增程序以高于退火温度10℃的温度为起点，每个循环降低0.5℃，反应20个循环后温度降为退火温度，在此退火温度下再进行15个循环。

7.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述DGGE电泳是在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上，200V电压、60℃温度下运行5个小时，细菌、真菌和放线菌DGGE电泳的变性剂浓度梯度分别是20-70％、30-60％和30-70％。

8.根据权利要求1所述的PCR-DGGE技术，其特征在于，所述对图谱进行数字化处理及聚类分析是指：首先应用Bio-rad的Quantity One软件获得DGGE图谱的数字化信息，然后使用NTSYSpc软件做聚类分析。

9.权利要求1～8任一项所述的PCR-DGGE技术在转基因作物根际土壤微生态安全性评价中的应用。