[发明专利]一种检测黄牛FGF21基因单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP(限制性片段长度多态性)方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是一种主要的脂肪代谢调节因子，具有调控能量代谢的作用，在动物模型中作为一个代谢调控子的发现引起了研究者的关注。FGF21在肝脏中特异的表达，可通过作用于脂肪组织及胰腺来降低血糖和甘油三酯含量，从而预防饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗。对于黄牛育种来讲，分析FGF21基因在牛脂肪代谢及能量平衡中的机制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。

国内外未见关于FGF21基因遗传变异的研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：体重等)关联的研究仍是空白。由于FGF21基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为FGF21基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛FGF21基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含FGF21基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因(全长1459bp，含3个外显子和2个内含子)，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，进行PCR扩增，用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切该四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性。

所述的引物对P1为：

上游引物：5′ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC  3′，

下游引物：5′CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA  3′；

所述的引物对P2为：

上游引物：5′GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG  3′，

下游引物：5′CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG  3′；

所述的引物对P3为：

上游引物：5′CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG  3′，

下游引物：5′TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG  3′。

将该三对引物的PCR产物送测序，根据测序结果及突变情况，在黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位处重新设计引物，并依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，以引物对F159、F297、F940、F1151为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因：

所述的引物对F159为：

上游F159-SalI：5′CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA  3′，

下游R159：5′TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG  3′；

所述的引物对F297为：