[发明专利]一种通过同源重组敲除manX的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物。几乎存在与所有有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分。氨基葡萄糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛。因此，临床上多用于治疗骨关节炎。此外，氨基葡萄糖还具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生；在医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎和胃溃疡疾病。在食品中，是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，还是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，此外也可用于化妆品和饲料添加剂中。

甲壳素水解法是我国目前生产氨基葡萄糖的主要方法，甲壳素水解法转化效率低，产生大量酸性废水，因而产品成本高、污染严重。目前，国内外对生物法生产氨基葡萄糖的报道较少，发酵产量也较低，尚未达到工业化生产的要求。

在发酵过程中当碳源葡萄糖浓度较低时，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被细胞当作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸转移系统(mannose PTS，II^Man，由manXYZ操纵子编码)和葡萄糖磷酸转移系统(glucose PTS，II^Glc，由pstG基因编码)对其进行磷酸化后从胞外向胞内转运，而N-乙酰氨基葡萄糖在从胞外向胞内转运时，依靠II^Man和乙酰氨基葡萄糖磷酸转移系统(GlcNAc PTS，II^NAG，由基因nagE编码)对其进行磷酸化后进行转运。因此，要想在胞外积累高浓度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必须对其转运途径进行阻断，减弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖从胞外到胞内的转运。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产氨基葡萄糖基因工程菌，所述重组菌为是克隆E.coli BL21(DE3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母S.cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因和甘露糖磷酸转移系统manX基因构建而成的重组大肠杆菌。

所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBank No.CP001509.3基因组中glmS片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gna1基因来源于GenBank NC_001138，大肠杆菌为E.coli K-12(ATCC25947)。

将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gna1连接到载体pET-28a(+)上。

本发明还提供了一种构建高产氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性内切酶Sac I和Hind Ⅲ对glmS基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET-28a(+)的Sac I和Hind Ⅲ位点之间；用限制性内切酶Not I和Xho I对gna1基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将gna1基因片断插入质粒pET-28a(+)的Not I和Xho I位点之间得到重组质粒pET-28a(+)-glmS-gna1。敲除E.coli ATCC 25947基因组中nagE和manX基因片段，得到nagE和manX基因失活的菌株E.coli-ΔnagE-ΔmanX，再将携带有glmS和gna1基因片段的质粒pET-28a(+)-glmS-gna1转化大肠杆菌E.coli-ΔnagE-ΔmanX中得到重组菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE-ΔmanX。

所述重组菌培养环境条件：

培养时间为12h，温度37℃，摇床转速200rpm，待OD₆₀₀达到0.6时，按照10％浓度加入乳糖(使发酵液中终浓度为5g/L)诱导glmS和gna1基因的表达。

所述重组菌培养基组成为：

种子培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4ml，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。；

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母膏24g，葡萄糖10g，按照50μg/ml加入卡那霉素，pH自然。