[发明专利]缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于重组蛋白及其在制药领域的应用，特别是涉及一种缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其制备方法以及作为药物在预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病中的应用。本发明是发明名称为“新型人角质细胞生长因子突变体”(专利号CN 03101156.X)的发明专利的延伸。

背景技术

角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)属于成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族，具有肝素结合特性。目前已发现两种角质细胞生长因子，即角质细胞生长因子-Ⅰ(KGF-Ⅰ)和角质细胞生长因子-Ⅱ(KGF-Ⅱ)，又分别被命名为FGF-7和FGF-10(Aaronoson SA et al，Ann N Y Acad Sci，1991，638：62-77)。人角质细胞生长因子-Ⅰ(hKGF-Ⅰ)最初由Rubin等人(Rubin JS et al，Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：802-806)从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离纯化，因具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故被命名为角质细胞生长因子；hKGF-Ⅱ是Emoto等人(Emoto H et al，J Biol Chem，1997，272：23191-23194)从肺中分离出编码KGF-Ⅱ的cDNA。

hKGF-Ⅰ基因位于15号染色体，编码含194个氨基酸残基的蛋白前体，包含一段31个氨基酸残基的分泌信号肽，成熟的hKGF-Ⅰ是一个含163个氨基酸残基的单链多肽。大量研究结果显示，hKGF-Ⅰ由间质细胞表达，通过旁分泌的方式作用于上皮细胞，是一种多功能的细胞生长因子，具有广泛的生物学作用。hKGF-Ⅰ能够促进包括肝实质细胞、胃肠上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、尿道上皮细胞、角膜上皮细胞和各种鳞状上皮的角化细胞等多种上皮细胞(Finch PW et al，Science，1989，245：752-755；Farrell CL et al，Int J Radiat Biol，1999，75：609-20；Farrell CL et al，Cancer Res，1998，58：933-939；Ellison CA et al，J Clin Immunol，2008，28：600-615；Terry NH et al，Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，58：435-444；Imayasu M et al，Curr Eye Res2003，27：133-141)的增殖、迁移、分化、存活，维持细胞骨架结构蛋白的稳定，拮抗辐射损伤、促进DNA修复以及诱导解毒酶的表达来加强上皮功能，有效保护上皮细胞免于毒性物质和射线的损伤。损伤修复过程中hKGF-Ⅰ可被大量诱生表达，促进伤口愈合，加快角膜上皮细胞损伤恢复的速度，缩短角膜上皮细胞愈合时间。

天然野生型hKGF-Ⅰ由163个氨基酸组成，分子量为21KD，含5个Cys，分别位于第1位、第15位、第40位、第102位和第106位，其中形成Cys1-Cys15、Cys102-Cys106两对二硫键，Cys40以游离巯基形式存在于分子内部(Osslund TD et al，Protein Sci，1998，7：1681-1690)。全长hKGF-Ⅰ蛋白质具有不稳定性，容易发生断裂和聚集，利用基因工程技术，通过突变或缺失某些氨基酸可以改善蛋白质的稳定性。文献报道(Osslund TD et al，Protein Sci，1998，7：1681-1690；Hsu E et al，Protein Eng Des Sel，2006，19：147-153和美国专利US 5677278)缺失N端23个氨基酸，且形成Cys102-Cys106二硫键(记为Δ23 hKGF-Ⅰ)时，不影响其生物活性，且会提高稳定性。该事实说明，N端第1-23位氨基酸及Cys1-Cys15二硫键与KGF-Ⅰ的生物学活性无关。本发明人曾将hKGF-Ⅰ天然序列第102位的Cys突变为Ser，使之无法形成Cys102-Cys106二硫键，并缺失N端24个氨基酸，形成新型的hKGF-Ⅰ突变体(记为102S Δ24 hKGF-Ⅰ)。该新型hKGF-Ⅰ突变体能促进角质细胞增殖和抑制成纤维细胞生长，具有抗疤痕、抗纤维化和促进表皮愈合的功能，该发明已获得中国专利(CN 03101156.X)授权。