[发明专利]缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其用途

权利要求书

1.一种具有新的生物学作用的缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体，其特征在于含有对应于天然人角质细胞生长因子-Ⅰ第40位和第106位半胱氨酸间的非天然二硫键结构。

2.权利要求1中所述缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ是指在天然野生型的氨基末端缺失23个氨基酸的缺失突变体，具有Seq ID No：1的氨基酸序列特征。

3.权利要求2中所述缺失突变体，同时包含在Seq ID No：1序列的基础上氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的类似突变体。

4.权利要求2-3中所述缺失突变体，优选同时包含在Seq ID No：1序列的基础上氨基末端增加1个甲硫氨酸(Met)。

5.权利要求2-4中所述缺失突变体，优选Seq ID No：1序列中第79位(对应于天然人角质细胞生长因子-Ⅰ的第102位)的半胱氨酸(Cys)突变为非极性氨基酸的突变体。

6.权利要求5中所述非极性氨基酸，主要指Ser、Ala、Gly、Thr、Leu或Ile。

7.权利要求5-6中所述非极性氨基酸，优选Ser，具有Seq ID No：2的氨基酸序列特征。

8.权利要求1-7中所述新型人角质细胞生长因子-Ⅰ缺失型突变体适用重组DNA技术制备而成。

9.权利要求8中所述重组DNA技术适用原核和真核表达系统，其中的原核表达系统可以是大肠杆菌，真核表达系统可以是酵母和哺乳动物细胞。

10.权利要求1中所述缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ的二硫键变构体是含一对非天然二硫键的重组人角质细胞生长因子-Ⅰ变构体。

11.权利要求10中所述二硫键变构体，通过特有的二硫键配对复性方法而实现，其主要步骤为：

①在碱性条件下用还原剂处理，使缺失型突变体第17位和第83位的Cys的巯基(-SH)均处于游离状态；

②在碱性条件下经菲洛林和铜离子配对复性，促进形成第17位和第83位Cys间非天然二硫键；

③采用色谱层析手段，从复性样品中分离并得到具有第17位和第83位Cys间非天然二硫键的变构体重组蛋白。

12.权利要求1中所述新的生物学作用是指缺失型突变体第17位和第83位Cys间形成非天然二硫键后，变构体分子构象发生显著变化，除保留原有促上皮细胞增殖的生物学活性外，还出现了新的生物学作用。

13.权利要求1和12中所述新的生物学作用包含抑制纤维增生和抑制新生血管生长。

14.权利要求13中所述新的抑制纤维增生的生物学作用适用于预防和治疗纤维化增生性疾病，包含但不限于慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化。

15.权利要求13中所述新的抑制新生血管生长的生物学作用适用于预防和治疗血管增生性疾病，包含但不限于视网膜黄斑、新生血管瘤以及肿瘤的血管增生。

16.权利要求14-15中的特征是含缺失型人角质生长因子-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白的药物组合，该药物组合为在有效剂量下制备而成的药物制剂。

17.权利要求16中所述药物制剂主要指液体水针、冻干粉针、缓控释剂、滴眼药剂、透皮制剂、粘膜喷剂、外用药剂以及脂质体药剂。