[发明专利]一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

多菌灵(carbendazim,CAS:10605-21-7)是一种广谱性的苯并咪唑类杀菌剂，对多种作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。多菌灵为结晶状粉末，熔点为302~307℃(分解)，蒸气压为0.09mPa(20℃)，密度为1.45(20℃)，水中的溶解度为29mg/L(pH4，24℃)，二甲基甲酰胺中的溶解度为5g/L(24℃)，微溶于有机溶剂中，低于50℃至少两年稳定，在碱性溶液中缓慢分解，随pH值升高，分解加快，在酸中稳定。其化学结构式如式Ⅰ所示：

（式Ⅰ）

虽然多菌灵为低毒类农药，但被广泛使用，我出口德国的脱水蘑菇中被多次检出有“多菌灵”残留，在1~10mg/kg左右，其达不到欧盟标准。欧盟于2007年2月26日发布了关于对90/642/EEC法规的修订案。其中关于多菌灵在新鲜菇类中的MRLs（最大残留量），由1mg/kg加严到0.1 mg/kg；干菇类中的MRLs，由10 mg/kg加严到1 mg/kg。我国和其它国家针对多菌灵在食品中的MRLs有明确规定，介于0.09-3 mg/kg之间。因此对于多菌灵的准确检测非常重要。

常用的检测方法有液相色谱法，竞争酶联免疫吸附法（ELISA），胶体金试纸检测等。液相色谱法仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，虽然检测准确，但并不适合广泛推广；胶体金法检测快速，价格便宜，但灵敏度低且容易出现假阳性；与以上两种方法相比，ELISA试剂盒法操作简便、快速，无需专业人员操作，仅需配备基础仪器设备，因此非常适合在食品企业中推广，同时由于其适合大批量样本筛选，因此配合仪器，可广泛应用于检验检疫、商检执法等部门，是非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多菌灵的单克隆抗体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下：

一种多菌灵的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No. 4575的小鼠杂交瘤细胞株MC-3产生。

能分泌抗多菌灵单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC-3，已于2011年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其分类命名为：Balb/C小鼠杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.4575。

本发明还提供一种上述多菌灵的单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）在多菌灵的第9位氨基酸残基引入1个氨基，得到经氨基修饰的多菌灵，再将该经氨基修饰的多菌灵与载体蛋白偶联得到完全抗原A；

（2）将步骤（1）的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到多菌灵的单克隆抗体。

其中，所述步骤（1）中，采用乙二醇法在多菌灵的第9位氨基酸残基引入1个氨基。

所述步骤（1）中，所述完全抗原A中的载体蛋白可为任意一种常用的载体蛋白，例如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）、钥孔血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）等，优选为钥孔血蓝蛋白（KLH）。

所述步骤（2）中，用于免疫的小鼠为Balb/C小鼠；免疫方法为：每只小鼠每次免疫所用的完全抗原A量为40μg~80μg，两次免疫的间隔时间为20~30天；免疫方式为皮下多点注射；

所述步骤（2）中，小鼠骨髓瘤细胞具体可为小鼠骨髓瘤细胞sp2/0。

所述步骤（2）中，筛选阳性杂交瘤细胞株的方法具体为：先用包被抗原筛选1~2次，再用偶联有载体蛋白的无关小分子筛选至少1次；所述包被抗原为所述步骤（1）中的多菌灵与载体蛋白偶联得到的完全抗原B；所述完全抗原B与所述完全抗原A中的载体蛋白不相同。

当完全抗原A中的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白时，所述完全抗原B中的载体蛋白具体可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清白蛋白。

所述偶联有载体蛋白的无关小分子可以为丁酰-BSA，苯菌灵-BSA，甲基硫菌灵-BSA（与多菌灵偶联方法一致）。

本发明利用上述免疫方法和筛选方法，用完全抗原A免疫小鼠，得到了只针对完全抗原上小分子多菌灵的抗体。

所述阳性杂交瘤细胞株为能分泌抗多菌灵单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC-3，其保藏号为CGMCC No. 4575。