[发明专利]一种赭曲霉毒素B的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及从赭曲霉毒素高产菌株的大米培养物中分离纯化赭曲霉毒素B(OTB)的方法。

背景技术：

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是一类对人和动物健康有害的真菌代谢产物，主要由赭曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)在适宜的环境条件下产生，基本结构为异香豆素连接到β-苯丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D等7种类型。

目前，赭曲霉毒素污染食品和中药材的问题日趋严重，为了保证检测分析所需赭曲霉毒素标准品的供给，获得大量、高纯度的赭曲霉毒素，我们选择了高产的赭曲霉进行大米培养，从中分离纯化出高纯度的赭曲霉毒素B，为该真菌毒素的深入研究提供了基础。

发明内容：

本发明的目的是提供从赭曲霉毒素高产菌株的大米培养物中分离纯化赭曲霉毒素B的方法。

本发明的技术方案依次包含如下方法步骤：

1.筛选高产菌株

2.分离纯化赭曲霉毒素B

具体实施方式：

下面所实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

1.筛选高产菌株

根据我们前期的工作基础，考察培养条件(温度、湿度、光照、pH值、碳源、氮源等)对产毒菌株生长及产毒量的影响，优化培养条件，筛选产赭曲霉毒素的高产菌株，通过大米培养，得到培养物。

2.分离纯化赭曲霉毒素B

应用反相中压制备色谱、凝胶LH-20柱色谱和反相高压制备色谱等技术对该培养物中的赭曲霉毒素进行分离和纯化，建立赭曲霉毒素B的制备方法。

对赭曲霉毒素高产菌株的大米培养物(2kg)进行粉碎，用80％的乙醇溶液加热回流提取4次，每次提取时间为2小时，合并提取液减压浓缩至无醇味时，转入分液漏斗中，采用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取四次后，合并萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物。将该萃取物溶于甲醇中，过滤除去不溶物，滤液浓缩后，采用反相中压制备色谱进行分离，依次以30％、50％、70％和100％甲醇/水溶液梯度洗脱，薄层检查各流份，对含有蓝色荧光的流份进行合并，合并后的流份浓缩过滤后，采用凝胶LH-20柱色谱分离，甲醇洗脱，得到含毒素的粗品，对该粗品进行反相高效液相制备色谱分离，薄层检查各流份，回收溶剂，得到白色固体，经甲醇重结晶后，得到无色晶体2mg。

赭曲霉毒素B(Ochratoxin B)^[1]，分子式为C₂₀H₁₉NO₆，分子量为369。ESI-MS：m/z 370[M+H]⁺，392[M+Na]⁺，761[2M+Na]⁺；¹H NMR(CDCl₃，600MHz)δ：8.32(1H，d，J＝7.8Hz，H-7)，7.21-7.29(5H，m，H-17～21)，6.83(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，4.99(1H，m，H-3)，4.76(1H，td，J＝6.0，4.2Hz，H-14)，3.32(1H，dd，J＝14.4，5.4Hz，H-15b)，3.19(1H，J＝13.8，6.6Hz，H-15a)，2.99(1H，m，H-4b)，2.97(1H，m，H-4a)，1.55(3H，d，J＝6.0Hz，H-11)；¹³C NMR(CDCl₃，150MHz)δ：173.6(C-22)，170.3(C-1)，164.2(C-12)，160.4(C-9)，143.9(C-5)，138.9(C-16)，136.4(C-7)，129.5(C-17，21)，128.6(C-18，20)，127.1(C-19)，119.2(C-6)，118.7(C-8)，108.8(C-10)，76.4(C-3)，54.3(C-14)，37.7(C-15)，34.7(C-4)，20.7(C-11)。

仪器和试剂

Bruker AV-600型超导核磁共振仪；LTQ Orbitrap XL质谱仪；德国LUMTECH液相色谱仪K-1001；薄层板GF₂₅₄(青岛海洋化工厂厂品)；试剂为分析纯(北京化工厂)。

薄层条件

展开剂：氯仿/甲醇/甲酸10∶1∶0.05(v∶v∶v)；检测波长254nm和365nm。

色谱条件