[发明专利]用化学修饰的引物相比于DNA优先扩增mRNA

权利要求书

1.一种选择性扩增信使RNA目标的方法，包括步骤：

a. 将第一寡核苷酸与所述mRNA目标杂交，用至少一种能够RNA-引导合成的酶进行RNA-引导的DNA合成，其中所述第一寡核苷酸：

     i. 包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸，

     ii. 与所述mRNA目标至少部分互补，和

     iii. 在目标中横跨外显子-外显子接头；

b. 用所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及至少一种能够DNA-引导的DNA合成的酶扩增步骤 a）的产物；其中所述第二寡核苷酸与所述mRNA目标至少部分互补。

2.权利要求1的方法，其中核苷酸的在环外氨基处被共价修饰的碱基选自N⁶-苄基-腺嘌呤、N⁶-对-叔丁基-苄基腺嘌呤、N²-烷基-鸟嘌呤、N⁴-苄基-胞嘧啶和N⁴-对-叔丁基-苄基胞嘧啶。

3.权利要求1的方法，进一步包含检测所述RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的产物的步骤c。

4.权利要求1的方法，其中所述能够RNA-引导合成的酶和所述能够DNA-引导的DNA合成的酶是相同的。

5.权利要求1的方法，其中所述一种或更多种酶基本上缺乏5’-3’核酸酶活性。

6.权利要求1的方法，其中所述至少一种酶选自Taq DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、delta-Z05 DNA聚合酶和delta-Z05-Gold DNA聚合酶或其突变体。

7.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。

8.用于选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的寡核苷酸，包含与所述mRNA目标至少部分互补、横跨目标中的外显子-外显子接头并进一步包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸的核苷酸序列。

9.权利要求8的寡核苷酸，其中所述在环外氨基处被共价修饰的碱基选自N⁶-苄基-腺嘌呤、N⁶-对-叔丁基-苄基腺嘌呤、N²-烷基鸟嘌呤、N⁴-苄基-胞嘧啶和N⁴-对-叔丁基-苄基胞嘧啶。

10.权利要求8的寡核苷酸，其中一种具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸的结构选自：

其中S代表糖部分，R代表修饰基团。

11.用于选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的反应混合物，该混合物包含至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子-外显子接头的第一寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸；以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。

12.选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的试剂盒，该试剂盒包含：至少一种与所述mRNA目标至少部分互补并横跨目标中外显子-外显子接头的第一寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处被共价修饰的碱基的核苷酸；以及至少一种与所述mRNA目标至少部分互补的第二寡核苷酸。

13.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物，进一步包含一种或更多种能够RNA-引导和DNA-引导的DNA合成的酶。

14.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物，进一步包含核苷三磷酸盐以及适合支持核酸聚合的有机和无机离子。

15.权利要求12的试剂盒或权利要求11的反应混合物，进一步包含检测核酸必需的试剂。