[发明专利]用于核酸特异性分析的探针

说明书

本发明涉及用于检测或富集复杂的核酸样品中的靶标核酸的方法。在此类方法中，将样品片段化，并通过核酸连接(“单侧连接”，即靶标片段的一端不涉及连接反应并且保持游离)使含有靶标核酸的片段在一端或接近一端处与每个靶标片段的单个靶标特异性探针共价结合。任选地，可以以非靶标特异性的方式对片段的所述游离端添加通用的核酸接头。探针可含有促进靶标片段富集的元件，所述富集例如通过纯化(例如通过固定至固相)或扩增(例如通过在探针和任选的接头中使用元件)进行。通过这种方式，可从复杂样品中获得靶标核酸，用于随后通过例如核酸测序、微阵列、qPCR、可视杂交探针、原位分析等进行分析。本发明提供(和使用)仅对靶标核酸(或靶标核酸片段)一端特异性的连接探针的特征是有利的，并且推进了使用已知方法不可能进行的具体应用。

通常期望分离大量亚基因组序列以允许对它们进一步表征，例如分离被认为与具体的生理或病理条件相关的基因组区。在出现高通量测序的平行方法之后尤其如此，所述高通量测序使得用于快速分离在此类测序方法中使用的感兴趣的基因组序列的方法成为必要。

用于从核酸样品中同时扩增(扩增构成根据本发明的“富集”手段)大量靶标核酸的一种已知的方法公开于WO 2005/111236中。在所述方法中，部分双链的“选择器(Selector)”核酸分子(其中更长的链在两端均悬突的单个对称分子，或是仅在一端具有单链悬突的两个不对称分子)通过它们的单链悬突以靶标特异性的方式与通过核酸样品片段化得到的单链(变性的)靶标片段的两端杂交(在单一对称选择器的情况下，杂交的选择器-靶标片段被环化(circularised))。在使用对称选择器的一个具体的实施方案中，仅靶标片段的一端与选择器的一端杂交，选择器的另一端与靶标核酸片段内部杂交，并且需要结构特异性内切核酸酶通过切除内部杂交区之外“突出”的靶标片段部分来拆解(resolve)得到的结构。因此，在所有情况下，靶标片段的可扩增部分由选择器被设计为与之杂交的已知序列的区域(两个末端区域或一端和一个内部区域)描绘(delineated)。杂交(和适当时次级结构的拆解)后，选择器和靶标核酸片段通过连接接合在一起，得到(i)在对称选择器的情况下环状核酸分子，和(ii)不对称选择器的情况下包含靶标片段的线性分子，所述靶标片段侧翼为选择器。选择器的双链区含有对多种型测定法(multiplex assay)中使用的大量不同靶标特异性选择器而言通用的引物对基序。因此，多种靶标片段的扩增可以同时实现，同时避免由于使用多种不同引物对而导致的扩增假象(artefacts)。

在WO 2005/111236的方法中，对每种靶标片段而言需要两种靶标特异性杂交事件；选择器与靶标片段的两条链杂交，或与一端和一条内部序列杂交。这不可避免地要求获知至少这两个杂交区域处靶标核酸的序列，从而设计靶标特异性杂交探针。

然而，通常期望以仅获知序列的一个区域为基础来分离或富集基因组序列或片段，即其中期望分离的片段(或序列区域)不与已知序列的区域(所描绘的)两端结合。当期望对序列/片段进行测序(即序列的至少部分未知)而导致需要分离靶标序列(例如片段)时，通常会是这种情况。一个具体的例子是染色体易位断裂点(breakpoints)的分析，其中期望测定与含有已知序列的另一染色体的区域融合的染色体区域的精确序列。其他例子包括分析剪接模式或VDJ重组事件。因此对下述方法存在需要，所述方法迅速并高效地检测(或富集或捕获)一种或多种靶标核酸，而不需要获知相应的靶标核酸片段两端区域的序列。

目前已经发现，可以通过使用单一(即单一种类的)探针来克服上述选择器方法的限制，即针对每种靶标核酸使用单一(或单一种类的)探针，所述探针对对应于靶标核酸的核酸片段中已知序列的区域具有特异性。也就是说，本发明以下述新颖特征为基础：针对每种靶标核酸仅使用一种靶标特异性探针，其在靶标核酸片段中以靶标特异性的方式仅结合一次(更特别地仅在一个位点上结合)。因此，对由核酸样品片段化得到的每种靶标核酸片段而言，仅发生一次靶标特异性杂交和连接(“结合”)事件；靶标特异性连接对靶标核酸片段而言是单侧的，因此只需要靶标核酸片段中单个已知序列区域来设计探针。也就是说，对每个靶标核酸片段中的探针而言仅需要一个确定的结合位点，即靶标片段的序列仅需要在一个位点(例如仅在一端)被定义。藉此，本发明的方法使得能够并且有利地简化并非在两端均为已知序列(即仅在一端具有已知序列)的基因组核酸的检测或富集。